Глава 7. Сельскохозяйственная биотехнология

7.1. БИОПЕСТИЦИДЫ

Убытки сельского и лесного хозяйства от насекомых-вредителей ежегодно исчисляются в мире около 100 млрд долларов. Долгое время для борьбы с ними использовались ядохимикаты, но, во-первых, они за­частую токсичны для животных и человека, а, во-вторых, ко многим ядохимикатам у насекомых развивается устойчивость. Все это привело к необходимости поиска новых эффективных средств борьбы.

Наиболее перспективным оказалось использование природных патогенов - микроорганизмов, чьи токсины являются причиной гибели насекомых-вредителей в их природных условиях. В настоящее время в различных странах мира производят более 30-ти микробиологических энтомопатогенных препаратов. Они характеризуются высокой специ­фичностью поражения определенных видов насекомых и практически полной безвредностью для человека, теплокровных животных, птиц и полезных насекомых.

Энтомопатогенные препараты, получаемые на основе микроорга­низмов, выделенных из естественных условий и внесенных вновь в те же условия в виде патогенных препаратов, не вызывают нежелательных изменений в биоценозах и не нарушают экологического состояния в ре­гионах.

Российская микробиологическая промышленность производит три группы энтомопатогенных препаратов:

1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis: энто- бактерин, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.

2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana.

3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдроза: вирин- ЭНШ и вирин-ЭКС.

Все микробные патогены выпускают в виде смачивающихся по­рошков или паст, реже гранул, эмульсии и кристаллов. При непосред­ственном применении чаще всего предполагают различные добавки в виде растворителей, эмульгаторов, способствующих повышению их эффективности.

7.1.1. Технология получения бактериальных энтомопатогенных

препаратов

Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее широко применяет­ся грамположительная бактерия Bac. thuringiensis, которая, помимо об­разования спор, вызывающих септицимию насекомого при попадании внутрь его тела, в ходе культивирования продуцирует ряд токсических соединений, повышающих эффективность приготовленных на ее основе препаратов. Среди таких токсичных продуктов, вырабатываемых этой бактерией, выделяют четыре компонента:

1. a-экзотоксин (фосфолипаза С) - продукт растущих клеток бак­терий. Он вызывает распад незаменимых фосфолипидов в тканях насе­комого, что приводит к их гибели.

2. b-экзотоксин, или термостабильный токсин. Накапливается в культуральной жидкости симбатно росту клеток. Его действие связано с ингибированием действия ДНК-зависимой РНК-полимеразы, что при­водит к прекращению синтеза РНК в клетках насекомых и к их гибели. Действие этого токсина довольно медленное.

3. 5-эндотоксин. Представляет собой кристаллический белок (имеет форму правильных кристаллов). Он не выделяется в культураль- ную среду, а остается внутри бактерии. Проявляет свое токсическое действие в желудочно-кишечном тракте насекомого, разрушая его фер­ментную систему.

Известно, что бактерии группы Bac. thuringiensis антагонистичны к 130-ти видам насекомых, среди которых вредители полевых, овощ­ных, плодовых культур, виноградников и леса. Наибольший эффект до­стигается при применении данной группы препаратов по отношению к листогрызущим вредителям.

Способность Bac. thuringiensis образовывать различные токсич­ные продукты, споры, кристаллы используется в промышленности при производстве на основе этого микроорганизма широкого круга различ­ных энтомопатогенных препаратов.

Все бактериальные энтомопатогенные препараты на основе Bac. thuringiensis производят по одной и той же технологической схеме. Тех­нология производства включает все стадии, типичные для любого мик­робиологического производства, основанного на глубинном способе получения микроорганизмов: выращивание посевного материала в ла­боратории и в посевном аппарате; промышленное культивирование в ферментаторе; концентрирование культуральной жидкости; сушку; стандартизацию и фасовку готового препарата.

Если посевной материал получают в виде спор, то на всех стадиях производственного культивирования используют питательную среду од­ного и того же состава. Как правило, это дрожже-полисахаридная среда, содержащая (в %): кормовые дрожжи - 2-3; кукурузную муку - 1-1,5; кашалотовый жир - 1. Если при выращивании посевного материала не предполагается доведение его до стадии образования спор, то в посев­ном аппарате применяют более концентрированные среды, чем в произ­водственных ферментаторах.

Перед началом культивирования рН среды не регулируют: при добавлении всех компонентов она устанавливается обычно около 6,3. К концу ферментации рН повышается до 8-8,5. Процесс культивирования заканчивают при степени спорулизации 90-95 % и титре спор не менее 10⁹ в 1 мл. Готовую культуральную жидкость перекачивают в отдель­ный простерилизованный сборник подкисляют до рН 6-6,2 и передают на стадию сепарации. В результате сепарации получают пасту влажно­стью 85 % с выходом около 100 кг в 1 м культуральной жидкости. Ко­нечным продуктом производства может быть либо смачивающий поро­шок, либо стабилизированная паста. Первый получают путем высуши­вания пасты на распылительной сушилке до остаточной влажности 10 % и смешением с каолином. Вторую - внесением в пасту карбоксиметил- целлюлозы (КМЦ). В этом варианте готовый продукт представляет со­бой вязкую жидкость светло-серого цвета, однородную по составу, не замерзающую при хранении, без запаха, не подвергающуюся гниению или брожению.

7.1.2. Технология получения грибных энтомопатогенных

препаратов

Энтомопатогенные препараты на основе микроскопических гри­бов способны поражать большое количество насекомых-вредителей, вы­зывая у них заболевание - микоз. По сравнению с бактериями и вируса­ми грибы обладают рядом особенностей: а) поражение происходит не через пищеварительный тракт, а непосредственно через поверхностные ткани; б) насекомые поражаются в фазе развития куколки, что не наблюдается при воздействии на них микробных препаратов; в) грибы характеризуются относительно большой скоростью роста и огромной репродуктивной способностью; в виде спор могут длительное время находиться в природных условиях без заметного снижения энтомопато- генной активности.

Воздействие грибного препарата на насекомое начинается с про­никновения споры гриба в полость его тела через кожные покровы. По­пав в тело насекомого, грибная спора прорастает в гифу, затем разраста­ется в мицелий, от которого отчленяются гифальные тельца - конидии, составляющие инфекционную единицу энтомопатогенных грибов. Как правило, гибель наступает от большого количества токсинов, выделяю­щихся грибами. Если же токсинов недостаточно либо насекомое не чув­ствительно к ним, гибель наступает после того, как нитевидный мице­лий заполняет все тело насекомого, поражая прежде всего мышечную ткань. В зависимости от размеров насекомого гибель наступает в пери­од от двух до восьми дней.

В России производится грибной препарат боверин на основе гри­ба рода Beauveria. Этот препарат применяют для уничтожения около 60- ти видов насекомых-вредителей, преимущественно жуков. Он безвреден для теплокровных животных и человека, не вызывает ожогов у расте­ний.

Получают боверин с помощью как глубинного, так и поверхност­ного культивирования промышленного штамма гриба.

Получение боверина методом глубинного культивирования

Получение боверина этим методом осуществляют в строго асеп­тических условиях. В состав питательной среды входят следующие компоненты (в %): дрожжи кормовые - 2; крахмал - 1; хлорид натрия - 0,2; хлорид марганца - 0,01; хлорид кальция - 0,05. Продолжительность культивирования составляет трое-четверо суток при температуре 25-28 ^оС. Выращивание гриба проводят в условиях постоянного пере­мешивания и принудительной аэрации. В ходе глубинного культивиро­вания гриба в течение первых суток-полтора кормовые дрожжи полно­стью лизируются, а гриб за это время проходит все фазы своего роста. К концу полного созревания гриба выделяется максимальное количество ферментов, что ведет к лизису мицелия и способствует накоплению ко­нидий. Готовую культуральную жидкость подвергают сепарации или фильтрации. После фильтрования получают пасту влажностью 70-80 %, которую направляют на распылительную сушилку. Высушенные споры представляют собой мелкодисперсный порошок влажностью 10 %. По­лученный порошок стандартизуют необходимым количеством каолина, иногда в качестве добавок в готовый препарат вводят смачиватель и прилипатель.

Технология получения боверина методом поверхностного культивирования гриба

Этот способ более длителен и трудоемок, поэтому имеет ограни­ченное применение.

Поверхностное культивирование гриба проводят как в жидкой пи­тательной среде, так и на полутвердых, на этих средах гриб обладает хорошей скоростью роста. Его микробиологическое производство за­вершается на стадии получения спороносной пленки, которую впослед­ствии снимают, высушивают, измельчают и при необходимости стан­дартизуют соответствующим количеством наполнителя. Среди возмож­ных приемов, используемых в производстве боверина поверхностным культивированием, различают: а) культивирование гриба на жидких средах без автоклавирования, перемешивания и аэрации; б) культивиро­вание на твердых автоклавированных средах без перемешивания и аэрации. Эти приемы основаны на том, что гриб хорошо растет на раз­личных растительных субстратах - отходах сельскохозяйственной про­дукции.

Культивирование гриба на жидких средах без автоклавирования, перемешивания и аэрации проводят без предварительной стерилизации среды, ее просто нагревают до кипения, разливают в деревянные карка­сы, покрытые изнутри полиэтиленовой пленкой. Среду, охлажденную до 30-40 ^оС, засевают сухими спорами. Сверху каркасы накрывают по­лиэтиленовой пленкой, которую после образования спороносной пленки гриба снимают. В качестве сред используют всевозможные отвары, например: из сахарной свеклы, картофеля, тыквы, зерна, муки.

В процессе культивирования гриба на твердых автоклавирован- ных средах без перемешивания и аэрации предусматривается стерили­зация размещенных по отдельным емкостям питательных сред (сусло- агар, картофель, морковь, кукуруза, корки арбуза) в течение сорока ми­нут при 110 ^оС. В стерильный субстрат вносят сухие споры, емкости с субстратом встряхивают до однородного распределения посевного ма­териала и оставляют стоять при температуре окружающего воздуха 18­23 ^оС. Образование конидиоспор завершается к концу 12-15 суток. Культуру гриба с остатками субстрата извлекают из емкостей и высу­шивают на стеллажах при 25-28 ^оС. Получение готового препарата за­вершают размолом материала до мелкодисперсного порошка.

7.1.3. Технология получения вирусных энтомопатогенных препа­ратов

Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наибо­лее высокой специфичностью по отношению к насекомому-хозяину: обычно они поражают только один вид, поэтому они практически пол­ностью безвредны для флоры, фауны и человека.

Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприятным воз­действиям окружающей среды (температуры, влажности), они способны сохранять свою активность в течение 10-15 лет, находясь вне насекомо­го.

Заражение насекомого вирусом происходит при питании вредите­ля. Попавшие в кишечник вирионы проникают в клетки организма, и в ядрах этих клеток происходит репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы поражают другие клетки до тех пор, пока насекомое не погиб­нет.

Отличительной особенностью производства вирусов является то, что они размножаются только в живой ткани. Поэтому производство любого вирусного препарата отличается от рассмотренных бактериаль­ных препаратов.

Технология любого из вирусных препаратов начинается с разве­дения насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обес­печивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития (обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, до­бавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предваритель­но получают от нескольких больных личинок. После выдержки, для максимального накопления вирусов в тканях насекомого (7-9 суток), собирают отмершие личинки, подсушивают их при 30-35 ^оС, измель­чают механическим способа для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистилли­рованную воду из расчета 1 мл на гусеницу, перемешивают и фильтру­ют (центрифугируют).

Готовые препараты изготовляют в виде водных растворов, масля­ных растворов, сухих порошков, паст и т. п.

7.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ УДОБРЕНИЯ

Присутствующая в почве микрофлора оказывает непосредствен­ное влияние на ее плодородие, а следовательно и на повышение уро­жайности. Почвенные микроорганизмы в процессе роста и развития улучшают структуру почв, накапливают в них питательные вещества, превращая органические и неорганические соединения в легкоусвояе­мые растениями компоненты питания.

С целью стимулирования деятельности почвенной микрофлоры разработаны различные бактериальные удобрения. В приктике сельско­го хозяйства нашли применение такие бактериальные удобоения, как нитрагин, азотобактерин и фосфоробактерин.

7.2.1. Технология получения сухого нитрагина

Нитрагин - бактериальное удобрение, приготовленное на основе жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium и предна­значенное для повышения урожая бобовых растений: гороха, фасоли, сои, люцерны, люпина и др. Бактерии способны фиксировать свобод­ный азот атмосферы, превращая его в легкоусвояемые растениями со­единения, поскольку в их организмах есть фермент - нитрогеназа. Нит- рогеназа восстанавливает молекулярный азот до аммиака, который во­влекается затем в ряд превращений с образованием глутамина и глута­миновой кислоты. Эти кислоты в дальнейшем идут на синтез расти­тельного белка. Этот процесс возможен только в симбиозе с бобовыми растениями: растение обеспечивает бактерии необходимыми питатель­ными веществами и создает для них оптимальные условия существова­ния, а бактерии, находясь в клубеньках, проросших в корни растения, снабжают его азотистым питанием. Ни растения, ни бактерии сами по себе не могут фиксировать азот.

В почве всегда есть некоторое количество клубеньковых расте­ний, которые располагаются на дикорастущих бобовых растениях. Од­нако при засевании полей бобовыми монокультурами клубеньковых бактерий оказывается недостаточно, вследствие чего растения снижают урожайность. При этом минеральные азотистые удобрения оказываются в данном случае бесполезными, поскольку азот усваивается только че­рез клубеньки. Поэтому производство бактериальных удобрений чрез­вычайно актуально.

Задачей конкретного производства бактериальных удобрений яв­ляется максимально возможное накопление жизнеспособных клеток, сохранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса и приготовление на их основе готовых форм препаратов с со­хранением их активности в течение гарантийного срока.

Сухой нитрагин - порошок светло-серого или коричневого цвета, который содержит в 1 г препарата не менее 9 млрд жизнеспособных клеток в смеси с наполнителем (бентонитом, каолином, мелом и пр.).

Промышленное производство нитрагина построено по типичной схеме асептического микробиологического процесса. «Узким» местом является стадия высушивания, поскольку именно на этой стадии бакте­рии могут потерять жизнеспособность из-за температурных воздей­ствий. Поэтому сушку осуществляют под вакуумом при 30-35 ^оС.

Для производства посевного материала исходную культуру клу­беньковых бактерий выращивают сначала на агаризованной среде, со­держащей, например, отвар семян бобовых растерий, 2 % агара и 1 % сахарозы. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду одного и того же состава, включающую такие ком­поненты, как мелассу, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двухзамещенный фосфат калия. Основную ферментацию проводят в течение двух-трех суток при температуре 28-30 ^оС и рН 6,5-7,5. Готовую культуральную жидкость направляют на сепарацию, в результате которой отделяется биомасса в виде пасты влажностью 70-80 %. Пасту смешивают с за­щитной средой, имеющей различный состав, но всегда содержащей ме­лассу и тиомочевину в соотношении 20:1, и направляют на высушива­ние. Процесс сушки осуществляют в вакуум-сушильных шкафах при 30-35 ^оС и остаточном давлении 10-13 кПа. Высушенную биомассу размалывают.

Нитрагин способствует увеличению урожайности бобовых на 15­25 %, а в районах, где бобовые засеваются впервые, - на 100 %. Вносят препараты путем опудривания семян непосредственно перед посевом.

7.2.2. Технология получения сухого азотобактерина

Азотобактерин - бактериальное удобрение, приготовленное на основе культуры свободноживущего почвенного микроорганизма Azotobacter chroococcum, способного фиксировать до 20 мг атмосферно­го азота на 1 г использованного сахара. Кроме того, эти бактерии выде­ляют в почву биологически активные вещества: никотиновую кислоту (витамин PP), пантотеновую кислоту, пиридоксин, биотин (витамин Н) и некоторые фунгицидные вещества, угнетающие развитие нежелатель­ных микроскопических грибов.

Все виды азотобактера - строгие аэробы. Бактерии этого вида очень чувствительны к наличию фосфора и развиваются при высоком содержании его в питательной среде. Технология получения азотобак­терина имеет много общего с технологией производства нитрагина, по­этому будут рассмотрены наиболее существенные отличия в его техно­логии.

Культуру микроорганизмов выращивают методом глубинного культивирования на среде, содержащей те же компоненты, что и при культивировании Rhizobium. Дополнительно вводят сульфаты железа и марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты. РН среды культивирования 5,7-6,5, аэрация - 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин.

Процесс ферментации проводят до начала стационарной фазы ро­ста культуры, так как в этой стационарной фазе биологически активные вещества выделяются из клетки и остаются в культуральной жидкости. При этом существует опасность, что с их выходом клетки могут утра­тить способность фиксировать атмосферный азот после внесения в поч­ву.

Биологически активные вещества полностью или частично могут теряться и в процессе высушивания клеток, однако оставшиеся жизне­способными клетки после выведения азотобактера из анабиоза восста­навливают способность продуцировать биологически активные веще­ства.

Использовать препараты азотобактерина рекомендуется лишь в плодородных почвах, содержащих фосфор и микроэлементы. Отсут­ствие последних отрицательно сказывается на жизнедеятельности вно­симых бактерий. Применяют азотобактерин для бактеризации семян, рассады, компостов. При этом улучшается корневое питание растений и на 10-15 % повышается урожайность зерновых, технических и овощных культур.

7.2.3. Технология получения фосфоробактерина

Фосфоробактерин - бактериальное удобрение, содержащее споры микроорганизма Bacillus phosphaticum. Бактерии обладают способно­стью превращать сложные фосфорорганические соединения (нуклеино­вые кислоты, нуклеопротеины и др.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты (пирофосфаты, полифосфаты) в доступную для растений фор­му. Кроме того, они также вырабатывают различные биологически ак­тивные вещества, в том числе витамины, стимулирующие рост расте­ний, особенно на ранних стадиях их развития.

По морфологическим признакам Bac. phosphaticum представляет собой мелкие, грамположительные, аэробные спорообразующие палоч­ки.

Технология его получения мало отличается от таковой для нитра­гина и азотобактерина.

Культуру Bacillus phosphaticum выращивают глубинным спосо­бом. Состав питательной среды следующий (в %): кукурузный экстракт - 1,8; меласса - 1,5; сульфат аммония - 0,1; мел - 1; вода - остальное. Культивирование проводят в строго асептических условиях при посто­янном перемешивании и принудительной аэрации до стадии образова­ния спор. Основные параметры проведения процесса: температура - 28­30 ^оС, рН среды - 6,5-7,5; длительность культивирования - 1,5-2 суток. Полученныю в ходе культивирования биомассу клеток отделяют цен­трифугированием и высушивают в распылительной сушилке при 65-75 ^оС до остаточной влажности 2-3 %. Высушенные споры смеши­вают с наполнителем (каолином).

В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфоробактерин обла­дает большей устойчивостью при хранении. Потеря жизнеспособности клеток после 1 года хранения не превышает 20 %.

Следует отметить, что фосфоробактерин не заменяет фосфорные удобрения, а резко увеличивает их эффективность, поэтому его вносят вместе с фосфорными удобрениями. Фосфоробактерин рекомендуют применять на черноземных почвах. Он необходим для повышения уро­жайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и других сельскохо­зяйственных растений.

Date: 2015-09-24; view: 1537; Нарушение авторских прав