Иммобилизация ферментов микрокапсулированием

Микрокапсулирование является одним из широко применяемых в последнее время методов физической иммобилизации, который, сохра­няя фермент в растворе фактически в нативном состоянии, дает воз­можность использовать его многократно, отделяя фильтрацией от про­дуктов реакции. Оболочка, непроницаемая для фермента и высокомоле­кулярных соединений, находящихся во внешней среде, позволяет в то же время свободно диффундировать через нее низкомолекулярным ве­ществам, например субстратам и продуктам.

В настоящее время существуют три основных метода заключения ферментов в полупроницаемые мембраны: межфазная поликонденса­ция, межфазная коацервация и двойное эмульгирование. При первом методе образование мембраны происходит в ходе химической реакции на поверхности раздела фаз, при втором - мембрана образуется за счет понижения растворимости полимера на границе раздела фаз. Двойное эмульгирование - это модификация метода межфазной коацервации, которая заключается в следующем. Водный раствор, содержащий фер­мент, эмульгируется в растворе полимера (в органическом растворите­ле), затем полученная эмульсия диспергируется в водной фазе с образо­ванием твердых сфер, содержащих водные микрокапли с включенным ферментом. Преимуществами этого метода являются достаточно мягкие условия приготовления биокатализатора, возможность выбора любых значений рН и практическая несжимаемость капсул даже в отсутствии наполнителей.

6.1.2. Химические методы иммобилизации ферментов

Главным отличительным признаком химических методов иммоби­лизации является то, что путем химического воздействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частно­сти, между белком и носителем.

Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалент- ных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов. В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необра­тимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилиза­цией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отде­ляют от носителя с помощью вставки, в роли которой чаще всего вы­ступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, глутаровый диальдегид и др.) (рис. 6.2).

Носитель Вставка Фермент Иммобилизованный фермент Рис. 6.2. Схема иммобилизации фермента химическим методом

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента участ­вовали функциональные группы, не существенные для его каталитиче­ской функции. Так, гликопротеины обычно присоединяют к носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы фермента.

Число методических приемов, разработанных для осуществления ковалентной иммобилизации ферментов, исключительно велико. Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента. Ниже представлен ряд примеров, иллюстриру­ющих некоторые способы химической иммобилизации ферментов.

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксигруппами

Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем является бром- циановый метод. При обработке носителя бромцианом возникают реак- ционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодей­ствии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют произ­водные изомочевины и уретанов: —OH

CNBr

_^O^C=NH имидокарбонат

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами

Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы бел­ков. Так, в щелочной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азосоединения, в составе которых белок связан с носителями:

фенольный радикал фермента

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы

Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, ак­
тивированные эфиры и другие производные карбоновых кислот. Например:

+ h₂n—[ф~|

Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами

Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода возду­ха:

[O]

H —sh + sh—[ф ------------- - H — s-s—[ф]

Иммобилизация путем химического присоединения биокатализа­тора к носителю отличается высокой эффективностью и прочностью связи. Несмотря на это, методы ковалентной иммобилизации ферментов все еще малодоступны для промышленного использования в связи со сложностью и дороговизной их применения. Однако они остаются не­заменимыми инструментами в практике проведения научных и лабора­торных исследований по созданию энзимов с контролируемыми свой­ствами.

Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с приме­нением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. Иными словами, при достаточно широком варьировании условий, таких, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а так­же для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в ана­литических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких, как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Именно химическими методами путем многоточечного ковалентного закрепления белковой структуры удается достигнуть наибольших эф­фектов стабилизации ферментов.

6.2. ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Иммобилизованные ферменты нашли широкое применение в та­ких областях, как медицина, сельское хозяйство, аналитическая химия и органическая химия.

Иммобилизованные ферменты имеют огромное значение для ме­дицины. В частности, большой рынок сбыта занимают тромболитиче- ские ферменты, предназначенные для борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Так, в отечественную клиническую практику внедрен препарат «стрептодеказа», содержащий стрептокиназу - активатор предшественника протеиназы плазмина, предотвращающий образова­ние тромба в кровеносной системе.

Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокислоты (например, аспарагиназа), используют для борьбы со злокачественным ростом опухолей. Протеолитические ферменты (трипсин, хемотрипсин, коллагеназа), иммобилизованные на волокнистых материалах (целлю­лозе, полиамидных волокнах, декстране и др.), применяют для эффек­тивного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы - в заместительной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов.

Исключительно важны с практической точки зрения работы, по­священные направленному транспорту лекарственных веществ. В этом отношении особенно выгодны инкапсулированные ферменты типа ис­кусственной клетки. Так, микрокапсулы, стенки которых представлены оболочкой эритроцита, а их содержимое заполнено ферментом аспара- гиназой, переносятся кровотоком к зонам скопления аспарагина и по­этому часто применяются для лечения аспарагинзависимых опухолей, в частности саркомы. Колонки, заполненные микрокапсулами с фермен­том уреазой, используют для диализа в аппарате «искусственная почка», которая работает в 100 раз эффективнее обычного аппарата. Принцип работы такой колонки следующий: мочевина разлагается уреазой до аммиака, который далее адсорбируется на активированном угле или

ионообменной смоле:

диффузия в уреаза _ ₊ адсорбция на

мочевина----------------------- мочевина ---------- hco₃ + nh₄----- смоле или акти-

микрокапсулу вированном угле

Из попыток применения иммобилизованных ферментов в мелко­масштабном производстве следует отметить их использование для трансформации стероидов. Так, например, применяемый при лечении артрита кортизол можно получить из дешевого предшественника 11- дезоксикортизола в колонне с иммобилизованной 11-Р-гидроксилазой, затем кортизол можно перевести в еще более ценный лекарственный препарат преднизолон в реакторе со слоем Д-дегидрогеназы. В настоя­
щее время подавляющее большинство трансформаций стероидов в про­мышленном масштабе осуществляют микробиологическим путем.

ch2oh

I ² c=o

'ioh

Иммобилизованные ферменты широко применяются в аналитиче­ской химии. Одним из примеров могут служить электроды с иммобили­зованными ферментами, позволяющие осуществлять непрерывный кон­троль за низкими концентрациями биохимически важных веществ. Так, в электроде для определения мочевины (рис. 6.3) иммобилизованная уреаза разлагает мочевину на ионы, которые могут быть обнаружены обычными электрохимическими методами.

Рис. 6.3. Электрод для определения мочевины

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов во многих жизненно важных отраслях народного хозяйства становится все более массовым. Выгодное сочетание избирательности и эффективности с долговечностью и стабильностью иммобилизованных ферментов в корне меняет химическое производство, способы добывания сырья, спо­собствует созданию новых биотехнологических процессов и методов терапии, совершенствует медицинскую диагностику, анализ, органиче­ский синтез и оказывает огромное влияние на образ жизни человека.

6.3. ПРОМЫШЛЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

В настоящее время лишь несколько процессов с использованием иммобилизованных ферментов имеют крупномасштабное применение. Эти процессы следующие:

1. Получение 6-аминопенициллановой кислоты с помощью иммо­билизованной пенициллинамидазы (Россия, Япония, Финляндия).

2. Получение глюкозо-фруктозных сиропов с использованием им­мобилизованной глюкозоизомеразы (США, Великобритания, Голлан­дия, Финляндия, Дания, Япония).

3. Разделение рацемических смесей аминокислот с использовани­ем иммобилизованной аминоацилазы (Япония).

4. Получение безлактозного молока с использованием иммобили­зованной лактазы (Чехия, США, Италия).

6.3.1. Разделение рацемических смесей аминокислот

Потребность в L-аминокислотах для производства пищевых про­дуктов и в медицинских целях постоянно возрастает. В связи с этим большое внимание уделяется разработке как микробиологических, так и химических методов получения L-аминокислот. Недостатком химиче­ских методов является рацемическая природа синтетических аминокис­лот. В общем случае D-аминокислоты не имеют питательной ценности, поэтому желательно получать только физиологически активные L- аминокислоты.

Указанная цель была достигнута в процессе, разработанном фир­мой Tanabe Seiyaku Co., Ltd. (Япония), в котором впервые в промыш­ленном масштабе применялись иммобилизованные ферменты. Основой процесса является метод разделения оптических изомеров в соответ­ствии со следующей реакцией, катализируемой ферментом аминоацила- зой:

nhcor

i

dl- r—c—cooh + h₂o h

dl-аминокислота

nhcor₁ nhcor-i

i ¹ i ¹ l- r-c-cooh + d- r—c—cooh hh

l-аминокислота d-ациламинокислота

Эту реакцию осуществляют в реакторах колонного типа с иммо­билизованной аминоацилазой. Общая схема процесса приведена на рис. 6.4.

Рис. 6.4. Технологическая схема процесса с применением иммобилизо­ванной аминоацилазы

Для разделения смеси рацемическую аминокислоту переводят в ацилированную форму и подвергают действию фермента аминоацила- зы, разрушающего ацильную связь и высвобождающего свободную аминокислоту. Фермент гидролизует амидную связь только L-изомера. В результате получается смесь свободной L-аминокислоты и ацилиро- ванной D-аминокислоты. Эти вещества, как правило, имеют разную растворимость (чаще всего в воде, иногда в других растворителях), по­этому их довольно легко разделить путем дробной кристаллизации. Оставшийся после разделения D-изомер нагревают, в результате чего он рацемизуется, после этого разделение повторяют до тех пор, пока весь изомер не перейдет в L-форму (обычно выходы превосходят 90 %).

Промышленный процесс заключается в следующем. Через колон­ну, заполненную аминоацилазой, иммобилизованной ионными связями на DEAE-сефадексе, пропускают раствор рацемической модифициро­
ванной по аминогруппе аминокислоты. После колонны раствор осто­рожно упаривают в вакууме: при концентрировании раствора первым выпадает в осадок менее растворимый компонент (как правило, это ацилированный D-изомер). Далее раствор фильтруют и упаривают еще раз для выделения свободной L-аминокислоты. D-Изомер растворяют и нагревают, при этом он рацемизуется, и его возвращают в колонну. В итоге добиваются высокой концентрации L-аминокислоты. Фермент аминоацилаза мало чувствителен к типу аминокислоты, поэтому одна установка с иммобилизованным ферментом может использоваться для получения самых разных аминокислот. Когда активность фермента па­дает, добавляют порцию свежего катализатора (один раз в несколько лет).

6.3.2. Производство кукурузного сиропа с высоким содержанием

фруктозы

Этот процесс с использованием иммобилизованных ферментов наиболее важен с экономической точки зрения.

Сахар (сахарозу) нельзя заменить D-глюкозой, поскольку глюкоза менее сладкая. К тому же кристаллизация концентрированных раство­ров глюкозы может затруднить их последующую переработку и хране­ние. Эти осложнения могут быть устранены, если глюкозу частично изомеризовать во фруктозу с помощью фермента глюкозоизомеразы:

CH₂OH

|=O

глюкозо-

HO-

изомераза H- H

D-фруктоза

При 50 ^оС константа равновесия этой реакции близка к единице, и изменение температуры практически не влияет на нее, поскольку тепло­та реакции изомеризации составляет всего лишь около 1 ккал/моль, по­этому продуктом реакции является смесь глюкозы и фруктозы в отно­шении приблизительно 1:1. Такая смесь значительно более сладка, чем чистая глюкоза и может с успехом заменять сахар в самых различных областях, в том числе в производстве безалкогольных напитков, приго­товлении различных пищевых продуктов и в хлебопекарной промыш­ленности.

Глюкозоизомераза представляет собой внутриклеточный фермент, продуцируемый рядом микроорганизмов, из которых используются главным образом некоторые штаммы Arthrobacter и Streptomyces. Необ-

ходимость дезинтеграции клеток достаточно мягкими методами, не вы­зывающими необратимую инактивацию фермента, приводит к повыше­нию стоимости глюкозоизомеразы по сравнению, например, с внекле­точными гидролазами. К тому же глюкозоизомераза очень чувствитель­на к ряду ингибиторов. Оба эти фактора предполагают целесообраз­ность иммобилизации глюкозоизомеразы.

На рис. 6.5 приведена схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы, основанного на использова­нии иммобилизованной глюкозоизомеразы. Здесь необходимость мно­жества операций разделения и обработки промежуточных продуктов между стадиями осахаривания и изомеризации диктуется свойствами ферментных систем. Так, для повышения устойчивости a-амилазы, применяемой для гидролиза крахмала (обычно этот процесс проводят при температуре около 105 ^оС) добавляют ионы кальция. Последние, однако, ингибируют глюкозоизомеразу, и поэтому их связывают ионо­обменными смолами прежде, чем декстрозный раствор поступит в реак­тор изомеризации.

Рис. 6.5. Схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы

Date: 2015-09-24; view: 3771; Нарушение авторских прав