Аминокислота - целевой продукт

Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутри- клеточно, то после 1-й ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный сок. В других случаях для целей биосинтеза це­левых продуктов применяют непосредственно клетки.

Получение лизина

Типичными продуцентами L-лизина являются бактерии Brevibac- terium flavum и Corynebacterium glutamicum.

Чтобы добиться образования лизина в больших количествах, полу­чают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего бло­кируется синтез метионина и треонина. Такие мутанты являются ауксо- трофами по гомосерину или треонину (метионину); внутриклеточная концентрация треонина у них существенно снижена, что снимает бло­каду с аспартаткиназы. Поэтому при выращивании мутантных штаммов в среде, где присутствуют лимитирующие концентрации метионина и треонина, они способны образовывать избыточные количества лизина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминиру­ющему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувстви­тельность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора — лизина.

Важный фактор, обеспечивающий в культуральной среде высокие концентрации аминокислоты, синтезированной внутри клетки, — про­ницаемость клеточных мембран. Проницаемость клеточной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 - 5 мкл/л), добавляют пенициллин (2 - 4 мкг/л), де­тергенты (твин-40 и твин-60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных стенок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы - глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторич­ное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. Технология этого процесса совершен­ствуется в направлении разработки дешевых синтетических питатель­ных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота применяют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для ус­пешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодо­вых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют необходимые для жизнеде­ятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Mn, Fe и др.). На про­цесс биосинтеза аминокислот существенное влияние оказывает снабже­ние воздухом, при этом степень аэрации индивидуальна для производ­ства каждой конкретной аминокислоты. Стерильный воздух подается специальными турбинными мешалками (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Технологическая схема получения кормового препарата лизина: I - подача свекловичной мелассы; 2 - водная суспензия кукурузного экстракта и питательных солей; 3 - нагревательная колонка; 4, 5 - теплообменники; 6 - посев­ные аппараты; 7 - подача посевного материала; 8 - система фильтров для очистки и стерилизации воздуха; 9 - ферментер; 10 - фильтры для очистки отходящих газов; II - получение монохлоридгидрата лизина; 12 - подача соляной кислоты; 13, 14 - выход и подогрев монохлоридгидрата лизина; 15 - выпаривательная установка; 16 - сборник ЖКЛ; 17 - смешивание ЖКЛ с наполнителем; 18 - распылитель; 19 - пода­ча горячего воздуха; 20 - очиститель воздуха; 21 - отделение сухого препарата ли­зина от воздуха; 22 - приемник ККЛ.

Опыты показали, что лизин появляется в культуральной среде, начиная с середины экспотенциальной фазы роста культуры клеток микроорганизма, и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение су­ток (рН 7,0 - 7,2; температура 28 - 30 °С), а затем подают в производ­ственный ферментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает поступать в культуральную жидкость через 25 - 30 ч после начала фер­ментации. По завершении процесса ферментации (через 55 - 72 ч) жид­кую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма фильтрованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фрак­ционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионо­обменной хроматографии на катионите. С этой целью лизин переводят в форму катиона:

NH3

₊ (CH2)4

h₃n-ch-cooh

Для данного процесса фильтрат обрабатывают соляной кислотой до рН 1,6 - 2,0 (рН < pKj). Обладая двумя положительно заряженными ионогенными группировками, лизин прочно сорбируется на смоле и элюируется с нее в виде индивидуального соединения 0,5 - 5 %-ном раствором гидроксида аммония после выхода всех других катионов. Элюат концентрируют в вакууме при температуре 60 °С, переводят в форму монохлоргидрата, после чего высушивают и дополнительно чи­стят с помощью перекристаллизации. В результате получают препараты кристаллического лизина 97 - 98 %-й чистоты, которые используют для повышения питательной ценности пищевых продуктов и в медицинской промышленности.

Кроме высокоочищенных препаратов лизина получают иные виды его товарной формы: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормо­вой концентрат лизина (ККЛ) и высококонцентрированные кормовые препараты, характеризующиеся относительно меньшей степенью очистки в сравнении с первым препаратом.

Получение глутаминовой кислоты

cooh (ch₂)₂ hon-ch-cooh

Глутаминовая кислота - это первая аминокислота, полученная микробиологическим путем. Мутантов, обеспечивающих сверхсинтез этой кислоты, не получено, а «перепроизводство» этой аминокислоты связано с особыми условиями, при которых нарушается синтез мем­бранных фосфолипидов. Глутаминовая кислота синтезируется исключи­тельно культурами Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum.

Субстратами для ее получения являются глюкоза и уксусная кис­лота, а в начале 60-х гг. прошлого столетия использовали и н-парафины. Особые условия для роста культур создаются добавлением к культу- ральной жидкости пенициллина, который подавляет синтез клеточной стенки, или уменьшением (по сравнению с оптимальной) концентрации биотина (витамина В₇) в среде, который индуцирует структурно- функциональные изменения в клеточной мембране, благодаря чему уве­личивается ее проницаемость для глутаминовой кислоты, выходящей из клетки в культуральную жидкость. В Японии с помощью селекции вы­делены температурозависимые штаммы бактерий (термофилы), которые продуцируют высокое содержание глутаминовой кислоты при повы­шенных температурах: в таких условиях достигают 50 %-го превраще­ния используемого источника углерода в глутаминовую кислоту.

Натриевая соль глутаминовой кислоты широко применяется в пищевой промышленности для улучшения вкуса продуктов питания в консервированном и замороженном виде.

5.1.2. Производство органических кислот

Органические кислоты можно получать как в анаэробных услови­ях (так называемые бродильные процессы), так и в аэробных условиях (окислительные процессы).