Эксперименты по изучению изолированных RyR-каналов

Изучая динамические особенности изолированных RyR-каналов независимо друг от друга несколько авторов исследовало поведение RyR-каналов в лабораторных условиях в липидных бислоях при постоянных концентрациях ионов Са²⁺ в растворе в условиях отсутствия кальциевой стимуляции [17-19]. Схема типичной установки представлена на рис. 1.7. В экспериментах раствор разделяется на две части липидным бислоем, имитирующим клеточную мембрану, в котором закрепляется RyR-канал. Та часть, которая соответствует люменальной стороне канала называется trans, цитозольной стороне – cis.

В работах [17-19] помощью подобных установок была проведена серия экспериментов по регистрации ионных токов, проходящих через одиночный канал при различных концентрациях Са²⁺ в растворе. Отсутствие тока указывало на нахождении канала в закрытом состоянии, а их присутствие – на его открытие.

Первым важнейшей особенностью RyR-канала как нанообъекта является стохастический характер процессов открытия/закрытия при постоянных значениях концентраций и [17-19].

Важной кинетической характеристикой поведения RyR-канала является вероятность пребывания канала в открытом состоянии (), равная отношению суммы времен пребывания в открытом состоянии к длительности эксперимента: . При разбиении сигналов на небольшие промежутки времени Т< 500 мс в работе [19] исследовалась временная зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии. Исследования показали неоднородность функции (рис.1.8).

График зависимости активности канала от времени можно разбить на участки (так называемые пучки (bursts)) с различной вероятностью нахождения канала в открытом состоянии. Данный эффект получил название модовой проводимости (Modal Gating) [21-23]. Так в работе [21] выявлены следующие моды проводимости RyR-канала: H (high ) – мода высокой активности, >0.1, L (low ) – мода низкой активности, 0< <0.1, I (inactivated mode) – мода нулевой активности, =0 (рис. 1.9).

Исследование зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии от значения концентрации Са²⁺ в trans-части показало [15, 24, 25], что в ответ на повышение увеличивалась частота открытий канала и вероятность (рис. 1.10). Из данного экспериментального факта можно сделать непосредственный вывод, что вероятность открытия RyR-канала увеличивается с ростом концентрации Са²⁺ в люмене.

В ряде работ [15, 21, 24], исследовавших влияние концентрации на активность RyR-канала, показано, что при повышении концентрации Са²⁺ в цитозоле (< 10 мкM) наблюдается резкое повышение частоты открытий канала и, соответственно, увеличение вероятности открытия одиночного канала. Далее, при достижении определенного значения концентрации (> 100 мкM) происходит спад , то есть наблюдается процесс инактивации RyR-канала при повышенной концентрации цитозольного кальция (рис.1.11).

Уменьшение значения при высоких значениях cis[Ca] объясняется многими исследователями [12, 15, 21, 26] тем фактом, что, являясь Са²⁺-активируемым рецептором, RyR-канал имеет на cis-стороне два типа активных центров, способных связаться с ионами Са²⁺: активационный и инактивационный [26-28]. На рисунке 1.12 изображена классическая схема активации/инактивации канала [27].

Сложная регуляция RyR-канала кальцием впервые была обнаружена в работе [29] при проведении экспериментов в плоском липидном бислое. Показано, что резкое увеличение cis[Ca] (~ 1 мс) сначала быстро активирует одиночный RyR-канал до высокого уровня вероятности , а затем значение медленно уменьшается со временем при фиксированной концентрации Са²⁺ (рис. 1.13). Этот эффект получил название адаптации канала к продолжительной стимуляции.

Следует отметить, что в экспериментальных работах повышение уровня cis[Ca] проводилось двумя способами: резкое повышение с помощью лазерного флэш-фотолиза [29-33] и постепенное повышение в растворе вблизи RyR-канала [34, 35]. Второй способ подразумевает градуальное повышение уровня вблизи активных частей канала вследствие диффузионных процессов.

Результаты экспериментов [35] по наблюдению эффекта адаптации при градуальном повышении говорят о том, что только в 30% реализаций обнаруживался эффект адаптации, в остальных 70% случаях понижения вероятности пребывания канала в открытом состоянии со временем не происходило (рис. 1.14). На основании этих фактов был сделан вывод: понижение со временем зависит от скорости увеличения уровня .

На основе приведенных данных можно сделать следующие выводы:

· Результаты экспериментальных исследований указывают на стохастический характер динамики RyR-каналов при постоянных значениях и .

· Зависимость вероятности от уровня имеет колоколообразный вид (при (0, 100) мкМ
возрастает, при >100 мкМ уменьшается).

· Вероятность открытия RyR-каналов прямо пропорциональна концентрации Са²⁺ в люмене.

· При резком повышении значении наблюдается эффект сначала резкого повышения , а затем медленного спада значения с течением времени до стационарного уровня – адаптация к продолжительной стимуляции.