Процессы апоптоза при экспериментальном повреждении спинного мозга

Борщенко И.А, Амин В.И., Сидоров Е.В., Желваков С.В.

Травматическое повреждение спинного мозга представляет собой непрерывный и многостадийный процесс, который начинается локально в зоне травмы и продолжается в виде распространенных дегенеративных изменений спинного мозга. Тяжесть повреждения последнего зависит как от силы первичного повреждающего фактора, так и от активации «внутренних» механизмов гибели клеток.

В последние годы процесс программированной клеточной смерти или апоптоза стал предметом детального изучения и при травматическом повреждении спинного мозга. В ходе этих исследований стало очевидно, что первичное некротическое повреждение клеток активирует каскад апоптозной гибели клеток, находящихся вне зоны повреждения [2]. Установлены некоторые медиаторы активации апоптоза и его молекулярно – генетические механизмы [12,14,15]. В настоящее время наиболее актуальным является выяснение временной и пространственной динамики апоптоза в травмированном спинном мозге с целью планирования возможных терапевтических мероприятий для предотвращения массивной гибели клеток [1].

Среди экспериментальных работ важное место занимают исследования по замещению дефекта поврежденного спинного мозга и стимуляции регенерации нервных волокон. В качестве трансплантатов используются как клетки нервной ткани - шванновские, оболочечные обонятельные, эмбриональные, так и неклеточные материалы – полимеризованный коллаген, Матригель, полигликоевая кислота, карбониловые нити [4,6,7,8,9,11].

В предыдущих работах Ф.С. Сатановой (НИИ мозга РАМН) в качестве трансплантата было выбрано вещество денатурированного куриного желтка и было показано его положительное влияние на процессы регенерации и выживаемости нейронов при травме спинного мозга [4].

В настоящее время имеются методы, позволяющие идентифицировать апоптоз в ткани мозга на морфологическом уровне. Среди них наиболее распространен метод TUNEL (Transferase-mediated dUTP nick end labeling) [16]. Эта иммунногистохимическая методика позволяет выявить клетки в состоянии апоптоза на самых ранних этапах разрушения ДНК [5].

Целью настоящего исследования явилось иммуногистохимическое изучение апоптоза при экспериментальной травме спинного мозга крыс, а так же определение возможного влияния трансплантации желтка на его морфологию.

Материалы и методы.

Для экспериментального повреждения спинного мозга были использованы 18 лабораторных крыс (самок) смешанной линии весом около 250 – 300 г. Наркоз осуществлялся комбинированием внутрибрюшинным введением этаминала и эфирной маски. Травма спинного мозга осуществлялась путем его полного поперечного пересечения с иссечением блока спинного мозга на протяжении 3-4 мм (на уровне Т9-Т10 позвонков). Животные были разделены на две группы. В опытной группе дефект спинного мозга заполнялся веществом стерильного денатурированного куриного желтка. В контрольной группе крыс трансплантация не использовалась, и дефект мозга заполнялся свертком крови. После пробуждения регистрировалось наличие полного поперечного повреждения спинного мозга. Умершвление животных производилось в следующие периоды после травмы: 4 часа, 3 суток, 14 суток, 40 суток и 3 месяца.

Спинной мозг фиксировался в 10% растворе забуференного формалина в течение 24 часов с последующей заливкой в парафин. Иммуно-гистохимическое исследование апоптоза методом ISEL проводилось на серийных срезах толщиной 5 мк. Детальное описание методики представлено в работе, опубликованной нами ранее [3].

Для количественной оценки процесса производился подсчет позитивно окрашенных элементов (ядер клеток и апоптозных телец) в 20 полях зрения. Продольные сагиттальные срезы всех препаратов были так же окрашены гематоксилином и эозином.

Результаты.

Исследование выявило определенную хронологическую зависимость апоптозной гибели клеток спинного мозга после острой экспериментальной травмы. В веществе спинного мозга неоперированой крысы (негативный контроль) клетки в состоянии апоптоза выявлены не были. В таблице 1 представлено количество ISEL позитивных клеток в контрольной и в опытной группах.

Через 4 часа после травмы в контрольной группе наблюдались клетки в состоянии апоптоза, которые выявлялись на всем протяжении исследуемого спинного мозга. Среднее число составило 8 клеток на 20 полей зрения. Апоптоз наблюдался только в глиальных клетках. Выявлялись единичные нейроны с дистрофическими изменениями (темные нейроны - тигролиз, единичные клетки «тени») без иммунногистохимических признаков апоптоза.

В опытной группе вещество желтка плотно прилежало к концевым фрагментам спинного мозга. Клетки в состоянии апоптоза выявлялись на всем протяжении спинного мозга, но их число было меньшим (в среднем 3 клетки на 20 полей зрения). Отмечалось так же меньшее число дистрофически измененных нейронов, особенно на отдалении от зоны повреждения.

На 3 - и сутки в контрольной группе процессы апоптоза были более интенсивными. Большинство клеток в состоянии апоптоза локализовалось вокруг зоны разрыхления и отека ткани – среднее число клеток составило 47. В зоне некроза появилась выраженная лимфоидная инфильтрация. Отмечалось увеличение числа погибших нейронов в зоне деструкции более чем в 3 раза по сравнению со сроком 4 часа после травмы. Наблюдалось так же начало процесса репарации в виде появления скоплений зернистых шаров.

В опытной группе число клеток в состоянии апоптоза было значительно меньшим – среднее число равнялось 6. В перифокальной зоне деструкции отмечалось формирование глио – мезодермального рубца.

К 14 суткам в контрольной группе процесс апоптоза продолжался, хотя его интенсивность несколько уменьшилась – среднее число клеток составило 37. Активизировались процессы замещения раневого дефекта грануляционной тканью, кроме того, апоптоз отмечался и в этой зоне. В нервной ткани спинного мозга выявлялись очаги полного выпадения нейронов с формированием мелких кистозных полостей.

В опытной группе в одном случае процесс апоптоза практически не прослеживался (2 клетки на 20 полей зрения), однако у второй экспериментальной крысы число апоптозных элементов резко возросло (61 клетка). Формирующийся глиально – мезодермальный рубец выглядел более «зрелым» по сравнению с контрольной группой.

Крайне выраженные различия между группами наблюдались на 40 день после травмы. В контрольной группе число клеток в состоянии апоптоза в нервной ткани превышало 100. Эти клетки концентрировались в области рубца, в котором так же наблюдались выраженные процессы апоптоза. На протяжении всего спинного мозга нейроны практически отсутствовали. На периферии препарата, то есть в шейном и поясничном утолщениях, в зонах выпадения нейронов формировались полости, а клетки в состоянии апоптоза располагались между зонами кавитации и рубцевания.

В опытной группе апоптоз фактически не прослеживался - среднее число клеток составило 4 с полным отсутствием апоптоза в рубце, в котором отмечалась высокая митотическая активность. На фоне менее выраженных процессов вторичного повреждения отмечалась относительная морфологичекая сохранность как глиальных, так и нервных клеток.

К 3 месяцам в контрольной группе интенсивность апоптоза значительно уменьшилась (в среднем 8 апоптозных клеток). Апоптоз локализовался в рубце и в нервной ткани в зоне травмы. Не периферии препаратов (шейное, поясничное утолщение) ISEL позитивные клетки не выявлены. Рубец муфтообразно распространялся на мозговые оболочки и окутывал фрагменты спинного мозга. В контрольной группе сохранились зоны запустения нейронов и кавитации нервной ткани на отдалении.

В опытной группе апоптоз фактически отсутствовал – в одном препарате клеток в состоянии апоптоза не найдено, в другом – 2 на 20 полей зрения. Меньшая интенсивность апоптоза сопровождалась большим числом сохраненных нейронов, формирующих цепочки. Морфология сформировавшегося рубца была идентична контрольной группе.

Таким образом, в настоящем исследовании нами был установлен факт апоптозной гибели клеток в веществе спинного мозга после его экспериментального повреждения. В контрольной группе число клеток в состоянии апоптоза увеличивалось к 3 - м суткам, далее понижалось и достигало максимальных значений к 40 - м суткам с постепенным уменьшением к концу исследования. В опытной группе животных с желтковым трансплантатом проявилась сходная динамика процесса. Тем не менее, имелось различие в количестве апоптозных клеток между этими группами животных: в группе с желтковым трансплантатом среднее число клеток в состоянии апоптоза было значительно меньше. Обращает на себя внимание один случай в опытной группе с большим числом клеток в состоянии апоптоза на 14 сутки. Это можно объяснить индивидуальными особенностями данного животного. В сравнении с истинным числом появившихся апоптозных клеток подсчет клеток в гистологическом срезе может давать несколько заниженные цифры, поскольку апоптоз это процесс завершающийся в течение нескольких часов, в ходе которых макрофаги успевают элиминировать все разрушенные клетки; кроме того, подсчет проводился только в одном срезе препарата.

Апоптоз был верифицирован только в глиальных клетках, тогда как признаков апоптоза в нейронах обнаружено не было. Одной из причин этого может быть специфический характер травмы, которая наносилась целиком при пересечении мозга в настоящем эксперименте: ткань удалялась из области травмы, кроме того, отсутствовал выраженный ишемический компонент, который неизменно присутствует при закрытой тупой травме спинного мозга. В литературе имеются противоречивые данные об апоптозе нейронов. Li et al. [12] продемонстрировали, что этот процесс завершается в течение первых 24 часов после травмы, в то время как Liu at al. [13] не обнаружили признаков апоптоза в нейронах спинного мозга через 4 часа, через 1 день, 4 и 9 дней после травмы спинного мозга. На протяжении посттравматического исследования число нейронов в ткани спинного мозга прогрессивно уменьшалось. Возможно, это происходило вследствие апоптоза нейронов, который не был детектирован.

При наличии трансплантата более низкое число апоптозных клеток сочеталось с большим числом сохраненных нейрональных и глиальных клеток в веществе спинного мозга. Возможно, ингибирование процессов апоптоза способствовало выживанию нервных клеток.

Процесс рубцевания активно протекал как в контрольной, так и в опытной группах. По видимому, это связано с тяжестью наносимой травмы, когда имелся обширный дефект ткани спинного мозга и протяженный контакт раневой поверхности с оболочками мозга, что способствовало формированию глиально - мезодермального рубца в короткие сроки. Примечательно, что в ткани формирующегося рубца так же идентифицированы процессы апоптоза, которые были менее интенсивными в опытной группе. Возможно, этот факт объясняет более быстрое «созревание» рубцовой ткани при трансплантации вещества желтка.

Заключение.

Изучение экспериментальной травмы спинного мозга позволило установить пространственно – временные характеристики процесса посттравматического апоптоза в нервной ткани. Процесс апоптоза максимальной интенсивности наблюдался в глиальных клетках на протяжении первых 8 недель после травмы.

Трансплантация желткового вещества в место дефекта спинного мозга создает впечатление эффективной в подавлении апоптоза, однако это явление требует дальнейшего изучения.

Таблица 1. Число ISEL - позитивно окрашенных элементов в разные периоды после экспериментальной травмы спинного мозга в 20 полях зрения.