ELISPOT әдісі туралы сипаттама жазыңыз

ELISPOT — Enzyme–Linked ImmunoSpot Assay — иммуноферментно белгіленген дақ тұжырым.
Мақсаты — сол немесе басқа еритін белоктарды секреттейтін және өндірілетін (АД, цитокиндер жекеленген жасушаларды есептеу, және т.б.).
Заттар:
1) АД жоғары арнайылығы (немесе сол арнайы лиганд) тұтас белокқа;
2) арнайы дақылды плэйттер біреуіндегі борпылдақ қатты фазадан (нитроцеллюлоза немесе материалдар тәрізді), сонда жиналған және иммобилизацияланған және сол жасушадан секреттелген;
3) Зерттелетін жасушалардың қасиетінің маңызы, яғни зерттеліп отырған заттардың (АД, цитокиндер немесе басқалары) қызықтырушы жасушалардың қалай секреттелуін және өндіріліуін түсінуге болады.
Технология қою әдісінің кезеңі: негізінде — сэндвич–ИФА. Ізінше, АД екі препаратын, арнайы және зерттелетін өнімге қолданады (цитокин немесе басқа.): қаты фазада біреуі – торға түсуі, екіншісінде — биотинмен бірге конъюгат, егер фермент авидтілігімен бірге немесе стрептавидтілімен бірге конъюгацияланған болса.
Залалсыздандырған жағдайда жұмыс істеу:
1) дақылды плэйтте қусыты қатты фазада іріктейдіа (бұл АД — цитокиннің секрет бөлу үшін торға түсуі);
2) бұл плэйтте зерттелетін жасушаларды орналастыру (әр түрлі концентрацияда суспензия алу — от 10⁵ до 2´10⁶ в 1 мл);
3) әр түрлі концентрацияда жасушаларға стимулятор қосады;
4) 2-24 сағ. ағымында керемет жағдайда жүйені дақылдандыру.
Залалсыздандырылмаған жағдайда жұмыс істеу:
5) жасушаны алып тастау мақсатымен лунканы тазалап жуады, сосын детергентпен бірге (0,05% Tween–20) жуылған буфермен (0,05% Tween–20), яғни барлығын жуу үшін, жаман байланысу үшін;

6) биотинмен бірге лункаға АД — АД₂ әсерлесуші конъюгат қосады, 2 сағ. инкубирлейді
7) жуады және авидин-пероксидаза конъюгатын қосады, 2 сағ. инкубирлейді;
8) ерітілген басында N₁N–диметилформамиде — DMF (100 мг АЕС на 10 мл DMF) — АЕС [3-амино–9-этилкарбазол жуады және субстраттық қоспаны енгізеді, және 0,1 M ацетат буферінде яғына дейін араласқан концентрациясы және плюс сутек пероксиді.
Рецепт субстратты қоспа: 333,3 мкл матрицалық ерітінді АЕС + 10 мл ацетатты буфер + 5 мкл 30% сутек перексиді];
9) 5-50 мин плэйтті жуу жолмен визуалды бақылаумен реакцияны тоқтату
10) плэйттерді мысалға 2 сағ. ағымында қараңғы бөлме температурасында кептіру;

11) нәтижесін тіркейді, яғни, дақты микроскопқа сәйкес санайды немесе «қолмен», немесе арнайы аппаратта, видеобейнемен лунка тубінің санайтын бейнесі және дақ нәтижесінің компьютер бағдарламасына сәйкес келуі.

Date: 2016-08-29; view: 664; Нарушение авторских прав