Методы генной инженерии

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одна из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Гены, которые нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помо­щью той же рестриктазы, поэтому его «липкие концы» являются ком­плементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазми- ды. Ферментом лигазой «сшивают» оба конца ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии называются кло­ном и содержат в плазмидах чужеродный ген, способный вырабатывать белок, кодируемый этим геном. Весь процесс получения таких бакте­рий, называют клонированием. Он состоит из последовательных ста­дий (см. рис. 4.1):

1. Рестрикции - разрезания ДНК человека рестриктазой на мно­жество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же ре- стриктазой.

2. Лигирования - включения фрагмента ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию «липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформации - введения рекомбинантных плазмид в бакте­риальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Их разде­ляют, используя определенную питательную среду (например, раствор антибиотика). Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининга - отбора среди клонов трансформированных бакте­рий тех, которые сохраняют плазмиды, несущие ген человека.

Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью ре- стриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей или не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктаза- ми. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с выре­зания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и- РНК, которая является транскрипционной копией этого гена, и с помо­щью фермента - обратной транскриптазы (ревертазы) - синтезируют комплементарную цепь ДНК, после чего и-РНК, служащая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой (ДНК-полимераза) ком­плементарной второй цепи ДНК. Получаемая двойная спираль ДНК но­сит название к-ДНК (комплементарная ДНК), она соответствует гену, с которого была считана и-РНК. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которая трансформирует бактерии, и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Рис. 4.1. Введение гена в плазмиду Escherichia coli и клонирование этого гена в клетках кишечной палочки Плазмида E.coli расщепляется рестрикционной эндонуклеазой в специфическом участке в обеих цепях ДНК, так что на концах расщепленной плазмиды располагаются короткие неспаренные последовательности дезоксирибону- клеотидов (ТТАА или ААТТ), т. е. по четыре нуклеотида, в которых основания представлены тимином и аденином. Ген, который нужно встроить в плазмиду, выщепляют с помощью этой же рестриктазы, так что его концы яв­ляются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают вместе с помощью лигазы. Затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку E.coli,которая, размножаясь, образует клон, все клетки которог содержат рекомбинантную плазмиду, а поэтому и чужеродный ген. Последний теперь клонирован в клетках кишечной палочки и индуцирует в ней синтез специфиче- скогобелка.

4.3. ПОЛУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

4.3.1. Биосинтез инсулина человека в клетках кишечной палочки

Инсулин - это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата. Последний, окисляясь, обеспе­чивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует перифе­рическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит рас­пад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активиро­вание синтеза жиров и белков. При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание - диабет; при этом разрушается нормальный об­мен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние - диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учиты­вая, что поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800-1000 кг исходного сырья. Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, толь­ко 4 млн получали препарат инсулина.

Инсулин построен из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот, последовательность которых была установлена Сэн- гером в 1955 г. Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены тремя коллективами исследователей в Сша, Китае и ФРГ в 1963 и 1965 гг. Однако осуще­ствить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Тем не менее в 1980 г. в Дании (компанией «Ново индастри») был раз­работан способ превращения инсулина свиньи в инсулин человека за­мещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в це­пи В на остаток треонина. Это удалось достигнуть путем ферментатив­ного замещения с последующей хроматографической очисткой продук­та; в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. Исследования двух однокомпонентных инсулинов (чело­веческого и свиного) показали, что они не различались по активности и по времени действия. В 1982 г. инсулин производили главным образом две компании «Эли Лилли» (85 % сбыта инсулина в США и патент на его производство с 1923 г.) и «Ново индастри» (47,5 % сбыта гормона в Европе).

В организме животного две полипептидные цепи инсулина ис­ходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 амино­кислот - препроинсулина. При синтезе препроинсулина в клетках под­желудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для про­хождения молекулы сквозь мембрану клетки; эти аминокислоты отщеп­ляются, образуется проинсулин длиной 86 аминокислот. Молекула про- инсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется с по­мощью ферментов. Так образуется инсулин. Роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсули­на.

Гилберт с сотрудниками выделили и-РНК из поджелудочной же­лезы крысы, синтезировали ДНК-копию (комплементарная ДНК), кото­рая была встроена в плазмиду E. coli в среднюю часть гена пеницилли- назы (этот фермент в норме секретируется из клеток), и получили ре- комбинантную плазмиду. Как показало определение последовательно­сти ДНК, рекомбинантная плазмида содержала информацию о структу­ре проинсулина, но не препроинсулина. При трансляции и-РНК в клет­ках кишечной палочки синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Далее отщепляли пенициллиназу и удаляли средний сегмент проинсулина действием трипсина. Позднее было показано, что полученные таким образом мо­лекулы влияют на сахарный обмен, как гормон, выделенный из подже­лудочной железы крысы.

В 1979 г. в США были синтезированы гены, кодирующие А и Б цепи инсулина. Далее каждый синтетический ген встраивали в плазми- ду E. coli в конце гена -галактозидазы. После этого синтезированные полипептиды отщепляли от фермента, проводили их очистку и цепи со­единяли in vitro для получения полной молекулы инсулина.

В клетках E. coli был также осуществлен биосинтез проинсулина, а не только отдельных ее цепей. Для этого на и-РНК проинсулина син­тезировали ее ДНК-копию с помощью обратной транскриптазы (ДНК- полимераза). Этот способ имеет серьезное преимущество, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены к миниму­му. С помощью этого метода был получен высокий выход гормона - 200 г на 1000 л культуральной жидкости (это эквивалентно количеству инсулина, выделенного из 1600 кг поджелудочной железы животных).

Исследователям из компании «Генентек» потребовалось 10 меся­цев, чтобы в сентябре 1978 г. получить инсулин человека в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Этот инсулин прошел самые серьезные и длительные испытания, которые показали, что он не вызывает никаких побочных явлений, как инсулин животных (у одного из каждых 20-ти больных инсулин животных вызывает аллергию; часто наблюдаются также расстройства почек и зрения). Кроме того, при длительном применении препарат не вызывал отрицательных иммуно­логических реакций.

Технология производства инсулина в бактериальных клетках име­ет огромные преимущества перед получением инсулина из поджелу­дочной железы животных: не зависит от перебоев или количества сы­рья, конечный продукт всегда имеет одинаковый состав и степень чи­стоты.

В октябре 1982 г. был налажен выпуск «хемулина» (препарата синтетического инсулина человека) фирмой «Эли Лилли», которая за­тратила 100 млн долларов, чтобы начать поставку продукта на рынок.

4.3.2. Биосинтез соматотропина и других гормонов человека

Гормон роста человека, или соматотропин, синтезируется в го­ловном мозге человека в передней доли гипофиза. Впервые он был вы­делен из трупного материала и очищен в 1963 г. При недостатке сома- тотропина развивается гипофизарная карликовость, частота встречаемо­сти которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек. Гор­мон обладает видовой специфичностью, т. е. в отличие от инсулина гормоны роста животных не имеют активности в организме человека. Следовательно, единственным средством излечения гипофизарной кар­ликовости является гормон гипофиза, который выделяли из трупов. Ис­следования показали, что при внутримышечном введении соматотропи- на в дозах 10 мг на 1 кг массы в течение года по три инъекции в неделю дает увеличение роста примерно на 8-18 см в год. Больные дети четы- рех-пяти лет при непрерывном лечении догоняли в росте своих сверст­ников к половой зрелости (14-16 лет).Если учесть тот факт, что из од­ного трупа можно получить 4-6 мг соматотропина, то можно понять, что лечение этого заболевания природным соматотропином - дело со­вершенно безнадежное. Помимо недостатка препарата возникли и дру­гие проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала. Существовала также опасность, что гипофизарный материал заражен медленно развивающимися вирусами. Такие вирусы обладают необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Гормон роста человека, синтезированный в специально сконстру­ированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он до­ступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.

Биосинтез соматотропина (состоящего из 191-го аминокислотного остатка) специально сконструированными бактериями на основе ки­шечной палочки был осуществлен фирмой «Генентек». Поскольку при синтезе ДНК на и-РНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, не расщепляющийся в бактериальных клетках с образо­ванием активного гормона, то поступили следующим образом: на 1 эта­пе клонировали двунитевую ДНК-копию и-РНК и расщеплением ре- стрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23-х первых аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклео- тид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фраг­мента объединили вместе и «подстроили» в плазмиду E. coli, после чего клетки бактерии начали синтезировать этот гормон.

К 1980 г. были закончены клинические испытания препарата и те­сты на токсичность и были начаты массовые эксперименты на детях, близких по возрасту к половой зрелости. Результаты были обнадежива­ющими, и синтетический соматотропин с 1982 г. начал производиться в промышленном масштабе.

Еще один гормон, b-эндорфин - опиат мозга, состоящий из 31-й аминокислоты, - был синтезирован в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. В 1980 г. австралийский ученый Шайн и американские ученые Феттес, Лэн и Бакстер успешно клонировали ДНК, кодирующую b-эндорфин, в клетках E. сoli и получили этот поли­пептид в виде слитного белка с ферментом b-галактозидазой. На первом этапе они клонировали фрагмент ДНК, полученный в результате обрат­ной транскрипции и-РНК, кодирующей b-эндорфин, и далее встраивали его в плазмиду E.coli за геном b-галактозидазы, при этом получили ги­бридный белок, состоящий из b-галактозидазы и b-эндорфина; далее ферментативно отщепляли b-галактозидазу, получая биологически ак­тивный b-эндорфин.

4.3.3. Получение интерферонов

Еще одним замечательным достижением генной инженерии явля­ется синтез интерферона.

Впервые интерферон был получен в 1957 г. в Национальном ин­ституте медицинских исследований вблизи Лондона. Это белок, кото­рый выделяется в очень низких количествах клетками животных и че­ловека при попадании в организм вирусов и направлен на борьбу с ни­ми. Первые же исследования выявили высокую биологическую актив­ность интерферона при лечении гриппа, гепатита и даже раковых забо­леваний (подавляет размножение аномальных клеток). Интерферон, как и соматотропин, обладает видовой специфичностью: интерфероны жи­вотных неактивны в организме человека и даже отторгаются им.

В организме человека вырабатывается несколько видов интерфе- ронов: лейкоцитарный (а), фибробластный (b) и иммунный (g) (Т- лимфоцитарный).

Природные интерфероны получают из крови человека с крайне низким выходом: в 1978 г. в Центральной лаборатории здравоохранения в Хельсинки (в то время мировой лидер в получении лейкоцитарного интерферона) из 50-ти тысяч литров крови было получено 0,1г чистого интерферона.

Процесс получения интерферонов в основных чертах был одина­ков для всех типов клеток, выращиваемых в культурах и образующих интерферон. Клетки крови заражали вирусом Сендай и через 24 ч филь­тровали на суперцентрифуге. В надосадочной жидкости содержался грубый препарат интерферона, который подвергали хроматографиче- ской очистке. Стоимость препарата была очень велика - 400 г интерфе­рона стоил 2,2 млрд долларов. Однако перспективность фармакологиче­ского его использования (в том числе против четырех видов рака) за­ставляла искать новые пути его получения, в первую очередь с помо­щью генной инженерии.

В январе 1980 г. был получен интерферон человека в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. Исходная трудность при этих методах заключалась в том, что и-РНК интерферонов мало да­же в лейкоцитах, стимулированных заражением вирусов, и в том, что выходы были очень низкие: сообщалось о получении 1-2 молекул ин­терферона на одну бактериальную клетку. В 1981 г. фирме «Генентек» удалось сконструировать рекомбинантную ДНК, кодирующую g- интерферон, и ввести ее в геном бактерий, дрожжей и даже клетки мле­копитающих, и они стали способными синтезировать интерферон с большим выходом - 1 л культуры клеток дрожжей содержал 1 млн еди­ниц интерферона (единица интерферона соответствует такому его коли­честву, которое защищает 50 % клеток в культуре от заражения виру­сом). Процесс был осуществлен следующим образом: исследователи выделили смесь молекул и-РНК из лимфоцитов человека, получили мо­лекулы соответствующих ДНК-копий и ввели их в клетки E. coli. Далее были отобраны бактерии, продуцирующие интерферон.

4.3.4. Получение иммуногенных препаратов и вакцин

Другая область применения генной инженерии связана с получе­нием новых эффективных, безопасных и дешевых вакцин.

Вакцины - одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять осо­бое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не уда­лось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения мно­гих распространенных или опасных инфекционных заболеваний.

Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболе­ваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественные новообра­зования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10-15 лет правительства многих стран стали принимать меры, направленные на интенсивную разработку и произ­водство принципиально новых вакцин.

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:

- живые аттенуированные вакцины;

- инактивированые вакцины;

- вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганиз­мов (протеины или полисахариды);

- рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микро­организмов, полученные методом генной инженерии.

Технологию рекомбинантных ДНК применяют также для созда­ния живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации пу­тем направленной мутации генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получе­ния живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие им- муногенные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в орга­низм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют иначе генными или генетическими.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию имму- ногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бакте­риальную плазмиду. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий проте­ин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходи­мы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое ко­личество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очи­щают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чуже­родных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбу­дителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с тра­диционными вакцинами:

- способствуют выработке антител к нативной молекуле вирус­ных протеинов;

- способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов;

- могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-лимфоцитов;

- способствуют формированию длительного иммунитета;

- устраняют риск инфицирования.

4.3.5. Другие области применения генной инженерии

Date: 2015-09-24; view: 1733; Нарушение авторских прав