Глава 3. Общая характеристика бактериальных S-слоев

Впервые регулярно организованные макромолекулярные монослои на поверхности клеток бактерий были найдены при помощи электронной микроскопии (Гайер, 1974; Сузина, Фихте, 1986).

Далее, в течение следующих 20 лет сходные структуры были обнаружены на поверхности еще некоторых бактерий, но счита­лось, что это редкие и не типичные для микроор­ганизмов структуры. Интенсивные исследования в 70-80 гг. прошлого века показали, что S-слои встречаются во всех исследованных родах бакте­рий и архей, причем у архей - это единственная жесткая оболочка (Messner et al., 1997; Murrell et al., 2000). К 2000 г. S-слои были описаны у 600 видов микроорганиз­мов, что составляет около 10% всех охарактери­зованных видов прокариот (Sara et al., 2000).

В настоящее время S-слой идентифицируется как присутствующий на поверхности клеток слой из регулярно организованных протеиновых или гликопротеиновых субъединиц. При этом упорядоченность организации белковых субъединиц так высока, что может считаться паракристаллической структурой (Koval, 1997). Исследования показали, что S-слои покрывают всю поверхность бактериальной клетки и, как правило, ассоциированы нековалентными связями с такими интегральными компонентами клеточной поверхности, как липополисахариды, тейхоевые кислоты, пептидогликан и др. (Miiller et al., 1999). Можно сказать, что это своеобразная биологическая мембрана, образовавшаяся в про­цессе эволюции. Широкое распространение S-слоев среди микроорганизмов свидетельствует об их важной роли в жизни бактерий. Располагаясь на поверхности клеток, S-слои непосредственно участвуют во взаимодействии клеток с окружающей средой, а также выполняют другие функции. Можно предположить, что они обеспечивают организму преимущество в естественных конкурентных условиях обитания. При длительном культивирова­нии в лабораторных условиях они, подобно некоторым другим поверхностным структурам, могут быть потеряны (Gruber et al., 1991). Эти данные свидетельствуют о том, что S-слои способствуют выживаемости микроорганизмов в естественных условиях существования.

Химический анализ S-слоёв показал, что большинство этих поверхностных структур состоит из одного высокомолекулярного полипептида с возможным присутствием ковалентно связанного углевода в качестве минорного компонента, который чаще всего является гетерополисахаридом. Полагают, что углеводная часть гликопротеинов S-слоёв играет важную роль в клеточной адгезии, поддержании конформации этих белков и устойчивости к протеолизу (Sleytr, 1997). Для белков S-слоя характерно высокое содержание неполярных и кислых аминокислот, а также небольшое количество или полное отсутствие серосодержащих аминокислот (Северина с соавт., 1995; Messneret al., 1997; Sara, Sleytr, 2000).

Основной метод обнаружения и исследования S-слоев - это электронная микроскопия, которая позволяет определить расположение субъединиц белков в S-слое, оценить общую геометрию, раз­мер пор (Sleytr et al., 1997; Engelhardt et al., 1998). Сравнительно недав­но для характеристики S-слоев стала применяться атомносиловая микроскопия (Miiller et al., 1999). Наряду с электронно-микроскопическими исследованиями появились работы по химическому составу и строению белковых субъединиц S-слоев (Engelhardt et al., 1998).

Для S-слоёв архей характерна гексагональная (р 3, р 6) симметрия. У эубактерий наряду с гексагональной обнаружены также тетрагональная (р 4) или наклонная (р 1, р 2) симметрии. Благодаря паракристаллической природе, S-слои имеют особую пористую структуру. Размер пор колеблется в пределах 2-8 нм, но постоянен на всех стадиях роста. Размер субъединиц S-слоев варьирует от 5 до 25 нм в толщину. Пористость может достигать 70%. S-слои составляют приблизительно 10 % всего клеточного белка.

Обнаружены микроорганизмы, содержащие более одного S-слоя (Sleytr et al., 1999). Например, клеточные стенки Bacillus stearothermophilus име­ют трехслойное строение: наряду с обнаружен­ным S-слоем содержат дополнительный белко­вый слой, расположенный под внутренней по­верхностью пептидогликанового слоя (Breitwieser et al., 1992). При этом отмечено, что при солюбилизации пептидогликана с помощью лизоцима два бел­ковых S-слоя сохраняются (Breitwieser et al., 1992).

У грамположительных бактерий S-слои ассоциированы с нижерасположенным пептидогликановым слоем (рис. 7), который является наиболее ригидным компонентом клеточной стенки, так что последняя может сохранять форму клетки даже после того, как вторичные клеточ­ные полимеры экстрагированы (Sleytr et al., 1997; Navarre et al., 1999). У грамотрицательных бактерий, имеющих более сложную поверхностную структурную орга­низацию (рис. 7), S-слои примыкают к липидному бислою снаружи внешней мембраны, а тонкий пептидогликановый слой также участвует в сохранении формы клетки наряду с внешней мембраной (Sleytr et al., 1997).

У палочкообразных бактерий белки S-слоя полностью покрывают поверхность, образуя строго упорядоченные решетки, довольно однородные на цилиндрической части поверхности, но имеющие дефекты в участках образова­ния межклеточной перегородки и на полюсах. Эти дефекты возникают, как правило, из-за сложной геометрии полюсов и участков образо­вания перегородки. Анализ распределения де­фектов показал, что составляющие S-слой субъединицы встраиваются в специфических сайтах и рекристаллизуются в процессе клеточного роста, поддерживая равновесное состояние с минимальной затратой энергии (Pum et al., 1999; Fjellbirkeland et al., 1997). Таким образом, S-слой является упорядоченной белковой сетью, требующей минимальное количество генетической информации и метаболической энергии для растущей клетки.

Рис. 7. Диаграмма трех основных типов бактериальных поверхностей, содержащих S-слои ( Sleytr et al., 1997 ). I. Ультратонкие срезы. II. Основные компоненты клеточной поверхности (молекулярная организация). III. Влияние на клеточные поверхно­сти обработки клеток методом замораживания с травлением. Строение клеточных поверхностей у архебактерий (а), грамположительных бактерий (b), грамотрицательных бактерий (с). СМ - цитоплазматическая мембрана, CW - ри­гидная клеточная стенка у грамположительных бактерий, состоящая из пептидогликана и/или других полимеров, ОМ - внешняя мембрана, PG - пептидогликановый слой, S - паракристаллический S-слой, Sa - локализация возмож­ного дополнительного S-слоя.

В отличие от архебактерий, у эубактерий S-слои, как уже указывалось, связаны с низлежащими слоями клеточной стенки. Работы, посвященные выяснению вопроса, каким образом осуществляется эта связь и какие соединения непосредственно в этом участвуют, крайне редки. По всей вероятности, рецепторным сайтом при присоединении белков S-слоев к клеточной стенке являются молекулы нейтральных полисахаридов, а точнее - их гидроксильные группы. Кроме того, показано, что способность белков S-слоя реструктурироваться и присоединять­ся к клеточным поверхностям может быть поте­ряна при изменении зарядов амино- и карбоксильных групп (Sara et al., 1992).

Существенный вклад в изучение молекулярной организации S-слоев внесли исследования с использованием методов электронной микроскопии (замораживание с травлением, негативное контрастирование, ультратонкие срезы, напыление металлами) (Fjellbirkeland et al., 1997). Так, с помощью электронной микроскопии и воссоздания трехмерного изображения с разрешением 2 нм была проанализирована упорядоченная поверхностная белковая структура Caulobacter crescentus (Smid et al., 1996). Присутствующий иногда на поверхности клеток микроорганизмов обильный гликокаликс может маскировать присутствие S-слоев, в особенности при использовании техники замораживания - травления. В других случаях этот метод дает очень хорошие результаты при изучении тонкой организации и структуры S-слоев (Beveridge et al., 1997). Однако для выявления S-слоев и ультраструктурного анализа чаще всего используют метод негативного контрастирования с высокой разрешающей спо­собностью (Sleytr et al., 1997).

Судя по данным электронной микроскопии, регулярно организованные S-слои могут иметь гексагональную (рб), тетрагональную (р4) и наклонную (р2) симметрию (Sleytr et al., 1997, 1999). Также обнаружены р 1и р 3 типы симметрии (Sara et al., 2000). Морфологически белковые субъединицы S-слоя состоят из гексамеров, тетрамеров или димеров с расстоянием между центрами симметрии от 5 до 32 нм (Sara et al., 1998). Для S-слоев архебактерий характерна гексагональная симметрия. У S-слоев эубактерий наряду с гексагональной обнаружены тетрагональная или наклонная (ко­сая) симметрия (рис. 8). Характерной чертой многих S-слоев является гладкая внешняя и более структурированная внутренняя поверхность (Sleytr et al., 1997; Fjellbirkeland et al., 1997).

Рис. 8. Электронная микрофотография реплик препаратов, полученных методом замораживания-травления S-слоев. а - Desulfotomaculum nigrijicans NCIB 8706 (тетрагональная симметрия, р4), Ъ - Clostridium therrnohydrosulfuricum LIII-69 (гексагональная симметрия, рб), с - Bacillus stearothermophilus 3а/NRS 2004 (наклонная симметрия, р2) (Sleytr et al., 1997).

Благодаря паракристаллической приро­де S-слои имеют особую пористую структуру. Раз­мер пор колеблется в пределах от 2 до 6 нм (Sara et al., 1992, 2000; Fjellbirkeland et al., 1997). Пористость "белковой сетки" в S-слоях ко­леблется в пределах от 30 до 70%. Таким образом, с помощью методов электронной микроскопии накоплен большой материал о принципах органи­зации S-слоев, а также об их структурных разли­чиях у разных микроорганизмов (Messner et al., 1992).

Данные о возможности использования S-слоев в целях таксономической идентификации бакте­рий весьма ограниченны и противоречивы (Sleytr et al., 1997, 1999). Предпринимались попытки сравнительного изучения структуры и химического состава S-слоев среди различных видов семейства Bacillaceae, в том числе и разных штаммов одного вида (Kuen et al., 1997; Egelseer et al., 1998; Sara et al., 2000), а также у Aeromonas salmonicida (Kay et al., 1984). Несмотря на большое сходство в аминокислотном составе, исследованные S-слои значительно различались у разных видов одного рода бактерий по молекулярному весу белков, входящих в состав S-слоя, степени гликозилирования белковых субъеди­ниц, размерам пор кристаллической решетки и некоторым другим параметрам (Howorka et al., 2000). Существенные различия по указанным свойствам S-сло­ев обнаружены у разных штаммов в пределах видов Pseudomonas acidovorans (Lapchine, 1979), Acinetobacter spp. (Thorne, 1977), Bacillus anaeurinolyticus (Kuen et al., 1997), Bacillus sphaericus (Chauvaux et al., 1999), Campylobacter fetus (Dworkin et al., 1997), Clostridium thermocellum (Lemaire et al., 1998), Haloferax volcanii (Eichler et al., 2001), Lactobacillus spp. (Callegari et al., 1998; Boot et al., 1999), Sulfolobus spp. (Pruschenk et al., 1987) и ряда других, причем некото­рые штаммы перечисленных видов вообще не имели S-слоя.

Следует указать, что исследование коллекционных культур на присутствие S-слоев должно быть сделано с учетом того, что некоторые эубактерии лишаются S-слоев в лабораторных условиях культивирования. Так, например, 30 из 39 штаммов Bacillus stearothermophilus имели S-слои, которые различались по структуре и молекулярной массе белков (Beveridge et al., 1997; Fjellbirkeland et al., 1997; Ward et al., 2004).