Поверхностные белки метанотрофов

Из всех известных на данный момент метанотрофов наиболее изученным является типичный представитель этой группы, термотолерант Mc. сapsulatus Bath, у которого определен спектр поверхностных белков и изучены их функции (Ward et al., 2004). При изучении спектра поверхностных белков у Mc. capsulatus Bath изначально были выявлены мембрансвязанные белки МорА, МорВ, МорС, МорD, и МорЕ с предполагаемыми м.м. 27, 40, 46, 59, 66 кДа, соответственно (Fjellbirkeland et al., 1997). При этом было показано, что МорС и МорD in vivo существуют в виде гетеродимера с общей м.м. 95 кДа, который, предположительно, принимает участие в транспорте ионов меди. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белка MopВ выявил в С-концевой области (между 291 и 306 аминонокислотами) консервативный участок NX2LSX2RAX2VX3L, характерный для белков семейства OmpA (наружных клеточных белков), участвующих в транспорте субстратов и поддержании структуры клеток. В N-концевой области MopВ расположены трансмембранные домены, характерные для мембранных белков.

Гибридизация антител к белку MopE с тотальными клеточными белками и белками культуральной жидкости выявила присутствие белка MopE в биомассе, а в культуральной жидкости - белка 45 кДа. Последующее секвенирование гена mop E и сравнение c N-концевой последовательностью белка 45 кДа, а также Вестерн-блот анализ, показали, что белок 45 кДа является С-концевым пептидом белка MopE, в котором пептид отщепляется после 204 аминокислоты - аланина (Fjellbirkeland, 2001). Количество экскретируемого пептида в среде достаточно велико и достигало примерно 0,4% от биомассы. Сравнение с известными белками выявило единственное сходство лишь в C-концевой области с белком CorA Methylomicrobium album BG8, предполагаемая функция которого состоит в транспорте и аккумуляции ионов меди. Обнаружено, что зрелый белок MopE, обозначенный как MopE^с, и выделяемый в среду 45 кДа пептид, обозначенный как MopE*, синтезируются в ответ на отсутствие или низкое содержание ионов меди в среде культивирования. В отличие от известных медь-связывающих белков, последовательность белка MopE не содержит характерного участка связывания меди: метионин-Х-цистеин-х-х-цистеин (Karlsen et al., 2003, 2011).

Кроме этого, анализ полной нуклеотидной последовательности генома Methylococcus capsulatus Bath выявил в одном опероне с геном mop Е, непосредственно перед ним, ОРС MCA2590 (Karlsen et al., 2005). Так как этот ген расположен под одним промотором с mop E, экспрессия которого подавляется ионами меди, то и уровень экспрессии МСА2590 также регулируется содержанием меди в среде. In silico анализ гена mca 2590 с использованием программ SIGNALP и PSORT показал, что кодируемый им белок после процессинга (расщепление между Ala41и His42) состоит из 732 аминокислот и обладает м. м. приблизительно 78 кДа. В белке МСА2590 выявлены две области, проявляющие высокий процент сходства с цитохромами с -типа, и обладающие цитохром-связывающими мотивами СХ₂СН.

Выравнивание аминокислотной последовательности белка MCA2590 показало его сходство с рядом бактериальных белков с неизвестными функциями (Photobacterium profundum (UniProt: Q6LQ47), Pseudomonas fluorescens (GenBank: ZP_00262397.1), Nostoc punctiforme (GenBank: ZP_00109402.2), а также довольно детально описанной цитохром- с пероксидазой (CCP) Nitrosomonas europaea (UniProt: P55929) и метиламин-утилизирующим белком MauG Paracoccus denitrificans (UniProt: Q51658). Несмотря на то, что с последними двумя белками, относящимися к семейству бактериальных дигемовых цитохром С пероксидаз (ВССР), сходство составляет менее 30%, их различия с МСА2590 практически не затрагивают функциональную область белка. Это позволяет отнести МСА2590 и сходные с ним белки к новой группе бактериальных пероксидаз, отличающихся от ВССР наличием добавочных элементов вторичной структуры. С помощью иммунного анализа и мечения биотином была показана локализация белка MCA2590 на поверхности клеток, что контрастирует с периплазматическим расположением описанных членов семейства ВССР (Karlsen et al., 2008).

Известно, что цитохромы способны удалять суперокид. Окисленный цитохром с может восстанавливаться как дыхательной цепью, так и суперокcидом, и регенерироваться путем окисления естественным акцептором электронов – цитохром с оксидазой. В геноме Mс. capsulatus Bath идентифицированно 57 белков, содержащих гем-связанный мотив, из них 5 - члены семейства цитохромов с₅₅₃₀ и 4 предварительно аннотированы как цитохром с пероксидазы (Bergmann et al., 1999; Ward et al., 2004; Elmorea et al., 2007; Karlsen et al., 2008). Цитохром с пероксидаза из Mс. capsulatus Bath является гомодимером с м. м. субъединиц 35,8 кДА и локализована в периплазме. Предположено участие этого фермента в детоксикации Н₂О₂ и окислении метиламина (Zahn et al., 2001).

В промоторной области выше 5^/ от MCA2590 обнаружена консенсусная последовательность, связывающая сайт транскрипционного фактора Fnr, 5^/-TTGATN(4)ATCAA-3^/, который регулирует (ан)аэробно-зависимую генную экспрессию в γ-протеобактериях. Продукт fnr A гена у Pseudomonus stutzeri контролирует экспрессию цитохрома cbb3, являющегося терминальной оксидазой, а также цитохром с пероксидазы и кислород-зависимой копропорфириноген III оксидазы.

С помощью иммунного анализа и биотинилирования показана локализация белка MCA2590 на поверхности клеток, что контрастирует с периплазматическим расположением всех описанных членов семейства дигемовых цитохром с пероксидаз. Хотя цитохром с пероксидазы выполняют защитную роль в периплазме, восстанавливая пероксиды, образуемые в окислительном метаболизме, увеличенный размер белка и его внеклеточная локализация подразумевают другие физиологические функции (Karlsen et al., 2005).

При изучении белков, участвующих в транспорте ионов меди, у Mm. album BG8, обнаружены три репрессируемых ионами меди мембранных белка, обозначеных Cu₁^rep, Cu₂^rep и Cu₂^rep с м. м. 28.5 и 33, и 49,5 кДа, соответственно (Berson et al., 1997). При этом в наибольшем количестве при снижении концентрации Сu²⁺ в ростовой среде синтезировался белок Cu₁^rep, обозначенный как CorA, о чем свидетельствует профиль тотальных клеточных белков, выявляемый ДСН-ПААГ-электрофорезом. Анализ транслированной аминокислотной последовательности гена cor A показал наличие N-концевого сигнального пептида и семи предполагаемых гидрофобных трансмембранных участков. Сравнение с последовательностями известных белков из базы данных выявило небольшое сходство (около 17,5% идентичности при сравнении 126 аминокислот в N-концевой последовательности) с белками кальциевых каналов человека и кролика. Кроме того, геном cor Aпоказал высокий процент его сходства c Cu²⁺-репрессибельным белком MopE Methylococcus capsulatus Bath (Fjellbirkeland et al., 1997). Это позволяет предположить, что белок CorA также является поверхностным, хотя детально его локализация не исследовалась.

Белок CorA оказался жизненно важным для метанотрофа, так как мутация по данному белку приводила к замедленному росту и неспособности мутантного штамма расти в жидкой среде. При этом добавление в среду меди в различных концентрациях не улучшало рост, указывая на возможное участие CorA не только в транспорте меди, но и в других жизненно важных функциях клеток (Berson et al., 1997; Karlsen et al., 2008).

У аэробных метанотрофов клеточная оболочка имеет типичное для грамотрицательных бактерий строение и включает цитоплазматическую мембрану, периплазму, слой пептидогликана и наружную мембрану. Вместе с тем наружная мембрана метанотрофов отличается по химическому составу от других грамотрицательных бактерий, поскольку существенной частью ее липидов являются редко встречающиеся у прокариот стеролы и гопаноиды, что может быть связано с использованием метана (Малашенко с соавт., 1978; Bodrossy et al., 1995). Биосинтез стеролов очень редко встречается у прокариот и их наличие было впервые показано у Mc. сapsulatus Bath. Были обнаружены 4-метил-l-5 -холест-8(14)-ен-3-ол, 4,4-диметил-5-холест-8(14)-ен-3-ол, 4-метил-5-холест-8(14)24-диен-3-ол и 4,4-диметил-5-холест-8(14),24-диен-3-ол (Lamb et al., 2007). Благодаря расшифровке генома Mc. capsulatus Bath, был идентифицирован путь биосинтеза стеролов.