Испытание на токсичность

Испытание проводят на здоровых белых мышах обоего пола массой

19-21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний.

За 24 ч до испытания и во время его проведения животные должны

находиться в помещении с постоянной температурой. За 2 ч до

взвешивания и отбора животных для проведения испытаний у них

отбирают корм и воду.

Каждую серию препарата испытывают на 5 мышах. Растворитель,

концентрация раствора (тест - доза) и способ введения указаны в

частных статьях.

Раствор препарата, подлежащего испытанию, подогревают до 37

град. С и в объеме 0,5 мл вводят в хвостовую вену мыши со

скоростью 0,1 мл/с, если в частной статье нет других указаний.

Если в частной статье предусмотрен иной путь введения

препарата мышам, объем раствора, вводимого в брюшную полость, под

кожу или в желудок, может быть увеличен до 1 мл. Введение в

желудок производят шприцем посредством инъекционной иглы, на конце

которой имеется наплавленная олива, или при помощи другого

приспособления, обеспечивающего поступление раствора или взвеси

препарата в желудок.

Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч, если в частной

статье нет других указаний.

Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение

предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна из

подопытных мышей.

В случае гибели одной мыши опыт повторяют на 5 мышах массой 20

+/-0,5 г; в случае гибели при первоначальном испытании двух мышей

повторное испытание проводят на 15 животных. Если при повторном

испытании ни одна мышь не погибнет, т.е. суммарная гибель животных

в двух опытах не превысит 10%, препарат считается выдержавшим

испытание. В противном случае препарат бракуют.

Для испытания на токсичность отбирают по 2 флакона или ампулы

от каждой серии, содержащей не более 10000 флаконов или ампул. При

количестве в серии флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3

флакона или ампулы от каждой серии. Для проведения испытания из

отобранных флаконов или ампул готовят общий раствор (смешанная

проба). Общее количество отобранного лекарственного средства

должно быть достаточным для проведения трех полных испытаний.

ИСПЫТАНИЕ НА ПИРОГЕННОСТЬ

Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола, не

альбиносах, массой 2-3, 5 кг, содержавшихся на полноценном

рационе. Каждый кролик должен находиться в отдельной клетке в

помещении с постоянной температурой. Колебания температуры не

могут превышать +/-3 град. С. При уборке клеток и взвешивании

животных их оберегают от возбуждения (избегать шума и резких

движений).

В течение недели, предшествующей опыту, кролики не должны

терять в массе. Взвешивание их проводят до дачи корма не менее 3

раз через день. Животные, теряющие в массе, к опыту непригодны. В

течение 3 сут перед испытанием у каждого подопытного кролика

измеряют температуру. Измерения проводят ежедневно утром до дачи

корма при помощи медицинского ртутного или электротермометра,

позволяющего определить температуру с точностью до 0,1 град. С.

Датчик термометра вводят в прямую кишку на глубину 7-9 см (в

зависимости от массы кролика) за внутренний сфинктер на время,

необходимое для достижения максимальной температуры. Исходная

температура подопытных кроликов должна быть в пределах 38,5-39,5

град. С. Животные с более высокой или более низкой температурой

для опыта непригодны. Кроме того, кроликов, впервые

предназначаемых для испытания лекарственных средств, проверяют на

реактивность путем внутривенного введения 10 мл/кг 0,9%

стерильного непирогенного раствора натрия хлорида,

соответствующего требованиям фармакопейной статьи. В случае

изменения температуры у кроликов более чем на +/-0,4 град. С

животные считаются непригодными для опыта.

Не позднее чем за 18 ч до опыта кроликов переводят в

помещение, в котором осуществляют испытание на пирогенность. Оно

должно проводиться в отдельной комнате с постоянной температурой,

не отличающейся от температуры помещения, в котором кролики

постоянно содержались до опыта, более чем на +/-2 град. С, и с

колебаниями во время испытания, не превышающими 2 град. С,

изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером накануне

опыта у животных отбирают остаток корма. До и во время опыта

животные корма не получают (воду дают без ограничения).

Если нет других указаний в частной статье, для испытания

отбирают не менее 2 флаконов или ампул от каждой серии, содержащей

от 1000 до 10000 флаконов или ампул. При количестве в серии

флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3 флакона или ампулы от

каждой серии. Из отобранных флаконов или ампул готовят общий

раствор (смешанная проба). От серии, содержащей до 1000 флаконов

или ампул, для испытания отбирают по 1 флакону или ампуле.

Вода для инъекций или другие применяемые растворители, а также

шприцы и иглы должны быть стерильными и непирогенными. Испытуемые

лекарственные средства должны быть стерильными. Их вводят кроликам

в ушную вену. Другие пути введения указывают в частной статье на

лекарственное средство. Для каждого кролика берут отдельную иглу.

Растворы испытуемых лекарственных средств, подогретые до 37 град.

С (при отсутствии других указаний в частных статьях), вводят в

количествах и растворителях, предусмотренных соответствующими

частными статьями. Для испытания на пирогенность воды для инъекций

предварительно готовят из нее изотонический 0,9% раствор натрия

хлорида. Натрия хлорид должен быть стерильным и непирогенным, что

обеспечивается воздушным методом его стерилизации при температуре

180 или 200 град. С в течение от 30 до 60 мин в зависимости от

массы образца. Шприцы, иглы и необходимую стеклянную посуду

стерилизуют этим же методом при температуре 180 град. С в течение

60 мин. Количество вводимого изотонического 0,9% раствора натрия

хлорида составляет 10 мл на 1 кг массы кролика. Все количество

раствора, предварительно нагретого до 37 град. С, вводят в течение

2 мин.

Испытуемый раствор проверяют на 3 кроликах. Группа должна

состоять из животных, близких по массе (отличающихся не более чем

на 0,5 кг). Перед введением раствора у кролика дважды с интервалом

30 мин измеряют температуру. Различия в показателях температуры не

должны превышать 0,2 град. С. В противном случае кролик для

испытания не используется. Результат последнего измерения

принимают за исходную температуру. Раствор вводят не позднее чем

через 15-30 мин после последнего измерения температуры.

Последующее измерение температуры при внутривенном введении

испытуемого раствора проводят 3 раза с промежутками в один час.

При других путях введения - 5 раз с промежутками в один час, если

в частной статье нет других указаний.

Воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают

непирогенными, если сумма повышений температуры у 3 кроликов

меньше или равна 1,4 град. С. Если эта сумма превышает 2,2 град.

С, то воду для инъекций или раствор лекарственного средства

считают пирогенными. В случаях, когда сумма повышений температуры

у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2 град. С, испытание

повторяют дополнительно на 5 кроликах. В этом случае воду для

инъекций или раствор лекарственного средства считают

непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов

не превышает 3,7 град. С. Если же эта сумма равна 3,8 град. С или

больше, воду для инъекций или раствор лекарственного средства

считают пирогенными.

В частной фармакопейной статье могут быть указаны другие

пределы отклонения температуры.

Если в частной статье на лекарственное средство нет других

указаний, случаи понижения температуры у кроликов принимают за

нуль.

Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для

определения пирогенности повторно, но не ранее чем через 3 сут,

если введенный им до этого раствор лекарственного средства или

вода для инъекций были непирогенными. Если же введенный раствор

лекарственного средства или вода для инъекций оказались

пирогенными, кролики могут быть использованы для дальнейших опытов

через 2 нед. При повышении температуры у кроликов в подобных

случаях на 1,2 град. С и более они используются через 3 нед. Если

исследуемые вещества обладают антигенными свойствами, то одних и

тех же кроликов нельзя использовать для испытания повторно (если

нет специальных указаний в частной статье).

Примечания. На основании опыта контроля на пирогенность

медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) допускаются

следующие особенности при испытании этих препаратов.

1. Испытание МИБП проводят на кроликах массой 1,5-2,5 кг.

2. Проверка реактивности кроликов является необязательной.

3. Термометр вводят в прямую кишку на глубину 5-7 см (в

зависимости от массы кролика).

4. Понижение температуры учитывают так же, как ее повышение.

5. Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для

определения пирогенности повторно (но не более 3 раз) с интервалом

2-3 сут, если ранее введенный препарат был непирогенным. Если

введенный препарат оказался пирогенным, кролики не могут быть

использованы повторно.

ИСПЫТАНИЕ НА СОДЕРЖАНИЕ ВЕЩЕСТВ

ГИСТАМИНОПОДОБНОГО ДЕЙСТВИЯ

Настоящая фармакопейная статья является общей и касается

метода испытания на содержание веществ гистаминоподобного действия

лекарственных средств, предназначенных для парентерального

применения.

Испытание проводят на кошках обоего пола массой не менее 2 кг

под уретановым наркозом. Уретан вводят внутрибрюшинно из расчета

1-1,2 г на 1 кг массы животного в 3-5 мл дистиллированной воды. В

случае недостаточной глубины наркоза вводят дополнительно

внутривенно уретан в количестве 1 г в 3 мл воды на животное или

этаминал - натрий в виде 2% раствора в количестве 0,2 мл/кг

внутривенно. Скорость введения указанных растворов 0,1 мл в

секунду.

Допускается также применение в качестве наркотического

средства гексенала в дозе 350-400 мг/кг в 2-3 мл воды под кожу или

внутримышечно.

Для регистрации артериального давления в отпрепарированную

сонную артерию вставляют канюлю, заполненную раствором,

предупреждающим свертывание крови (насыщенный раствор натрия

гидрокарбоната, 25% раствор магния сульфата, раствор гепарина,

содержащий 50 ЕД в 1 мл, и др.), и соединяют ее с ртутным

манометром. Запись давления производят на ленте кимографа.

Испытуемые растворы вводят внутривенно.

Вначале проверяют чувствительность животного к гистамину.

Для приготовления основного раствора гистамина, содержащего 1

мг гистамина - основания в 1 мл воды, около 138,1 мг (точная

навеска) гистамина фосфата или около 82,8 мг (точная навеска)

гистамина дигидрохлорида растворяют в 50 мл дистиллированной воды.

Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла с

притертой пробкой в защищенном от света месте при температуре от 4

до 10 град. С.

В качестве основного раствора гистамина можно использовать

также 0,1% раствор гистамина дигидрохлорида в ампулах, в 1 мл

которого содержится 0,6038 мг гистамина - основания.

Из основного раствора гистамина непосредственно перед опытом

путем последовательных разведений в воде или в растворе натрия

хлорида изотонического 0,9% для инъекций в зависимости от

растворителя для испытуемого препарата, указанного в

соответствующей статье, готовят стандартные растворы, содержащие

0,5 и 1 мкг/мл гистамина - основания.

Для проверки реакции животного на гистамин в вену

последовательно вводят указанные стандартные растворы с

промежутками не менее 5 мин в дозах 0,1 и 0,2 мкг

гистамина - основания в 0,2 мл на 1 кг массы. Скорость введения

раствора 0,1 мл в секунду. Животных, у которых при введении

гистамина в дозе 0,2 мкг на 1 кг массы артериальное давление

снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из опыта исключают.

После проверки чувствительности животного к гистамину уточняют

величину гипотензивной реакции посредством повторного введения

стандартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг (0,2 мл раствора)

на 1 кг массы со скоростью 0,1 мл в секунду. Введение гистамина с

интервалом 5 мин повторяют несколько раз, пока при двух

последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение

артериального давления, которое принимается за стандартное в

данных условиях опыта.

Затем с интервалом не менее 5 мин животному вводят испытуемый

раствор лекарственного средства с той же скоростью, с которой

вводили раствор гистамина.

Растворитель и концентрация испытуемого раствора (тест - доза)

указаны в соответствующей фармакопейной статье. Препарат считают

выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после

введения тест - дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг

гистамина в стандартном растворе.

При испытании в одном опыте разных лекарственных средств

необходимо проводить дополнительное определение реакции животного

на введение стандартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг/кг.

Отмеченная при этом величина реакции принимается как стандартная

для последующего испытания препарата.

В случае значительного уменьшения величины реакции по

сравнению с наблюдаемой в начале опыта необходимо вновь проверить

чувствительность животного к действию гистамина в дозе 0,2 мкг/кг.

Если снижение артериального давления при этом будет не менее 20 мм

рт. ст., испытание препаратов продолжают в соответствии с

указанными выше требованиями,

Для испытания на содержание веществ гистаминоподобного

действия отбирают по 2 флакона или ампулы от каждой серии,

содержащей не более 10000 флаконов или ампул. При количестве в

серии флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3 флакона или

ампулы от каждой серии. Из отобранных флаконов или ампул готовят

общий раствор (смешанная проба) для испытаний.

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ИСПЫТАНИЕ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

Лекарственные средства для инъекций, глазные капли, мази,

пленки, другие лекарственные средства, в отношении которых имеются

соответствующие указания в нормативно - технической документации

(НТД), должны быть стерильными. Стерильность лекарственных средств

достигается соблюдением необходимых санитарно - гигиенических

условий их изготовления и режима стерилизации.

Методы контроля стерильности, изложенные в данной статье,

применяют для испытания всех лекарственных средств независимо от

их природы и лекарственной формы, если нет других указаний в

частных фармакопейных статьях.

Отбор образцов для анализа. Образцы готовых лекарственных

средств отбирают для контроля от каждой серии в количествах,

зависящих от вида стерилизации и числа единиц (ампул, флаконов и

т.д.) в серии.

В случае, если лекарственное средство стерилизуют насыщенным

паром при избыточном давлении 0,11 +/- 0,02 МПа (1,1 +/- 0,2

кгс/кв. см) и температуре (121 +/- 1) град. С, образец состоит из

10 единиц. При других видах стерилизации минимальное количество

---

образцов для анализа определяют по формуле n = 0,4 \/ N, где n -

число единиц в образце, а N - число единиц в исследуемой серии

препарата, при этом n должно быть не менее 3 и не более 40.

Определение антимикробного действия лекарственного средства.

Во избежание неправильной оценки результатов анализа необходимо

определить однократно для каждого наименования лекарственного

средства, обладает ли оно антимикробным действием. Для этого в две

пробирки с 10 мл тиогликолевой среды и в две - с 10 мл среды

Сабуро добавляют соответствующее количество исследуемого

лекарственного средства (табл. 12) и вносят в каждую пробирку по

0,1 мл микробной взвеси соответствующего тест - штамма, содержащей

1000 клеток в 1 мл. Посевы в тиогликолевой среде инкубируют при

температуре от 30 до 35 град. С в течение 48 ч, а на среде Сабуро

- при температуре от 20 до 25 град. С в течение 72 ч.

Контролем служат пробирки с питательными средами, в которые

вместо данного лекарственного средства вносят аналогичное

количество дистиллированной воды или соответствующего

растворителя.

Для проверки антибактериального действия лекарственных средств

используют тест - микроорганизмы: Staphylococcus aureus АТСС 6538

Р, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, а

противогрибкового действия - Candida albicans ATCC 885-653 (см.

табл. 13).

При отсутствии антимикробного действия лекарственного средства

в контрольных и опытных пробирках (колбах) должен наблюдаться рост

перечисленных тест - микроорганизмов.

При наличии антимикробного действия лекарственных средств

используют соответствующие инактиваторы, указанные в частных

фармакопейных статьях: (напр.: пара - аминобензойная кислота для

сульфаниламидов, пенициллиназа - для пенициллинов и цефалоспоринов

и т.д.). При отсутствии инактиватора препарат разводят, изменяя

соотношение объемов посевного материала и питательной среды.

Первоначально, не изменяя количества посевного материала,

указанного в табл. 12, увеличивают объем питательной среды до 250

мл. Если при этом сохраняется антимикробное действие

лекарственного средства, уменьшают объем посевного материала до 1

мл.

В случае неэффективности разведения лекарственного средства

используют метод мембранной фильтрации.

Посев лекарственных средств. Для контроля стерильности

лекарственных средств применяют тиогликолевую среду и жидкую среду

Сабуро. При этом используют метод прямого посева на питательные

среды или метод мембранной фильтрации.

Метод прямого посева. Испытуемый препарат, если необходимо,

растворяют в соответствующем растворителе и высевают в

количествах, указанных в табл. 12.

При испытании лекарственных средств посевы в тиогликолевой

среде инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С, а в среде

Сабуро - от 20 до 25 град. С. Продолжительность инкубации посевов

в обеих питательных средах составляет 14 сут.

Таблица 12

Количество испытуемого препарата для посева

в зависимости от объема содержимого единиц

(ампул, флаконов и др.), составляющих серию

------------------T--------------T-------------------------------

¦Объем содержимого¦ Объем ¦ Объем питательной среды ¦

¦одной единицы, мл¦лекарственного¦ ¦

¦ ¦ средства для ¦ ¦

¦ ¦ посева, мл ¦ ¦

+-----------------+--------------+-------------------------------+

¦Менее 1 ¦Весь объем ¦В 10 раз больше объема образца ¦

¦1 - 4 ¦1 ¦для посева ¦

¦5 - 19 ¦2 ¦ ¦

¦20 - 100 ¦2 - 4 ¦ ¦

¦Более 100 <*> ¦10 ¦ ¦

L-----------------+--------------+--------------------------------

--------------------------------

<*> Если объем содержимого единицы превышает 100 мл,

предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации.

В случае помутнения питательной среды после внесения в нее

испытуемого препарата следует в интервале от 3 до 7 сут. после

посева сделать пересев на свежие аналогичные среды и инкубировать

их при соответствующей температуре 14 сут от начала испытания.

При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах

отбирают асептически по 0,1 г (мл) от каждой единицы и вносят в

стерильную колбу вместимостью 250 мл, содержащую стеклянные бусы,

100 мл 1/15 мол фосфатного буферного раствора (рН 6,8-7,0) и

эмульгатор. Перед проведением испытания содержимое колбы

подогревают до температуры (41 +/-1) град. С. Колбу с испытуемым

образцом встряхивают не более 30 мин до получения однородной

эмульсии. Полученную эмульсию в количестве 5 мл переносят в колбу

с 40 мл тиогликолевой среды и 5 мл - в колбу с 40 мл среды Сабуро.

Посевы инкубируют 14 сут при соответствующей температуре для

каждой питательной среды.

Примечания. 1. Выбор эмульгатора и его количество зависят от

природы мази и растворов лекарственных средств в маслах. Наиболее

часто применяют твин-80 в концентрации до 2,5%, не оказывающей

антимикробного действия.

2. При испытании мазей, легко эмульгируемых в воде, эмульгатор

не вносят в буферный раствор.

3. При испытании мазей и растворов в маслах предпочтительнее

использовать метод мембранной фильтрации.

Метод мембранной фильтрации. При определении стерильности

лекарственных средств, обладающих выраженным антимикробным

действием, и лекарственных средств, разлитых в емкости более 100

мл, используют метод мембранной фильтрации.

При испытании лекарственных средств с антимикробным действием

от каждой серии независимо от ее объема отбирают 30 емкостей

(ампул, флаконов и др.), которые делят на 3 группы по 10 емкостей.

Емкости двух групп (20 штук) используют для испытания на

стерильность, третьей группы (10 штук) - для контроля полноты

отмывания мембраны от лекарственного средства.

Испытание лекарственного средства на стерильность проводят с

использованием фильтрационной установки, включающей

фильтродержатель, соединенный с колбой - приемником.

Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из

пористой пластины, на которую помещают мембрану. Используют

мембраны с размером пор 0,45 +/-0,02 мкм, диаметром около 47 мм.

Испытания проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 см рт. ст.) при

скорости вытекания воды 55-75 мл в 1 мин. Допускается

использование аппарата, представляющего собой стерильную замкнутую

систему и работающего также по принципу фильтрации растворов.

Для фильтрации водных, масляных и спиртовых растворов

рекомендуют использовать фильтры из эфиров целлюлозы или смесей

эфиров целлюлозы. Фильтровальную установку в собранном виде

стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11 +/- 0,02

МПа [(1,1 +/- 0,2) кгс/кв. см] и температуре (121 +/-1) град. С в

течение 20 мин (температура и время критические). Стерилизацию

можно осуществлять любым другим способом, обеспечивающим

сохранность рабочих характеристик мембраны, а также стерильность

мембраны и всей установки (ионизирующее излучение, окись этилена и

т.п.).

Испытуемое лекарственное средство растворяют или суспендируют

(если в этом есть необходимость) в соответствующей стерильной

жидкости и полученный раствор или суспензию пропускают через

стерильную мембрану. Для растворения лекарственных средств с

антимикробным действием и отмывания мембраны от них можно

использовать любой растворитель, не подавляющий роста

микроорганизмов, например, раствор натрия хлорида изотонического

0,9% для инъекций. Используемый растворитель перед стерилизацией

необходимо профильтровать через мембраны с порами размером 0,45

+/-0,02 мкм для освобождения от механических примесей.

Фильтрование отобранных образцов проводят в асептических

условиях. Испытуемый раствор пропускают с помощью вакуума через

одну или несколько мембран. При испытании лекарственных средств с

антимикробным действием или содержащих консервант после окончания

фильтрации мембрану необходимо промыть 3-5 порциями по 100 мл

соответствующего растворителя, например растворам натрия хлорида

изотонического 0,9% для инъекций или жидкости N 1 (см. с. 193),

при испытании мазей - жидкости N 2 (см. с. 193). После отмывания

мембраны ее извлекают, разрезают стерильными ножницами пополам и

одну половину помещают в колбу со 100 мл тиогликолевой среды,

вторую - в колбу со 100 мл среды Сабуро. Питательные среды с

помещенными в них фильтрами выдерживают при температуре от 30 до

35 град. С (тиогликолевая среда) и от 20 до 25 град. С (среда

Сабуро) в течение 7 суток при ежедневном просмотре.

Для контроля стерильности растворов лекарственных средств,

выпускаемых в виде порошков, лиофилизированных препаратов и пр.,

содержимое каждой емкости предварительно растворяют в стерильном

растворителе. Затем из каждых 10 емкостей одной группы отбирают

полученный раствор в количестве, соответствующем 200 мг

лекарственного средства, и переносят в колбу, содержащую 100 мл

аналогичного растворителя. Приготовленный раствор немедленно

фильтруют. После отмывания фильтра, как указано выше, одну

половину его помещают в колбу с тиогликолевой средой, вторую - в

колбу со средой Сабуро.

При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах

от каждой из 10 емкостей отбирают по 100 мг препарата в колбу со

100 мл растворителя (изопропилмиристат и др.), который

предварительно подогревают до температуры не выше 45 град. С и

стерилизуют фильтрованием через мембраны с размером пор

(0,22 +/- 0,02) мкм. После фильтрации образца мембрану промывают

двумя - тремя порциями по 200 мл жидкости N 2 и затем одной -

двумя порциями жидкости N 1. Половину мембраны помещают в

тиогликолевую среду, другую - в среду Сабуро, в которые

предварительно вносят стерильный твин-80 из расчета 1 г на 1000 мл

среды.

При испытании лекарственных средств, разлитых в емкости

большого объема, через фильтры пропускают содержимое 5-10

емкостей, если объем каждой емкости составляет от 100 до 500 мл.

При наличии в емкости более 500 мл раствора на стерильность

испытывают по 500 мл содержимого каждой из 5- 10 емкостей на 2-3

мембранах.

При испытании лекарственных средств, представляющих собой

вязкую жидкость или медленно фильтрующиеся суспензии, необходимо

предварительно добавить растворитель, указанный в частной статье,

для увеличения скорости фильтрации.

Контроль полноты отмывания фильтра (третья группа емкостей)

проводят следующим образом: при испытании антибактериального

лекарственного средства в колбу с тиогликолевой средой и

погруженной в нее половиной фильтра вносят суточную культуру

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Р, при испытании противогрибкового

лекарственного средства - в колбу со средой Сабуро и фильтром

вносят 48-часовую культуру Candida albicans ATCC 885-653 из

расчета 100 микробных клеток на весь объем среды. Инкубацию

проводят при соответствующих температурах. Наличие роста

тест - микроорганизмов в контрольных колбах через 48-72 ч

свидетельствует о достаточной полноте отмывания мембран от

антимикробного лекарственного средства.

Для контроля стерильности условий, в которых проводят

испытания, необходимо фильтровать растворитель без испытуемого

лекарственного средства с последующим воспроизведением всех

вышеописанных операций.

Учет и интерпретация результатов испытания на стерильность.

Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании

периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных

средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и

других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов

необходимо подтвердить микроскопированием мазков, окрашенных по

Граму.

Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям

испытания на стерильность при отсутствии роста микроорганизмов.

При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе)

его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком

же количестве образцов, как и в первый раз. При отсутствии роста

микроорганизмов при повторном посеве испытуемый препарат считают

удовлетворяющим требованию испытания на стерильность. В случае

роста микроорганизмов при повторном посеве, морфологически сходных

с микроорганизмами, выявленными в первичном посеве, испытуемый

препарат считают нестерильным. Если при повторном посеве

наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от

первоначально выделенных, испытание повторяют в третий раз на

удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста

микроорганизмов после инкубации посевов в третьем испытании

испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям на

стерильность. При наличии роста хотя бы в одной пробирке

испытуемый препарат считают нестерильным.

Питательные среды

Для контроля стерильности применяют "Сухую питательную среду

для контроля стерильности" (тиогликолевую) отечественного

производства (ТУ 42.14 N 161-79) и среду Сабуро (жидкую). Вместо

коммерческой тиогликолевой среды может быть использована

тиогликолевая среда индивидуального приготовления.

Состав и приготовление питательных сред. Тиогликолевая среда

индивидуального приготовления:

панкреатического гидролизата казеина 15,0 г

дрожжевого экстракта (10%) 5,0 >>

натрия хлорида 2,5 >>

глюкозы 5,0 >>

цистина (цистеина) 0,75 >>

тиогликолевой кислоты или 0,3 мл

тиогликолята натрия 0,5 г

раствора резазурина натрия 1:1000

(свежеприготовленного) <*> 1,0 мл

агара 0,75 г

воды дистиллированной до 1000 мл

рН после стерилизации 7,0 +/- 0,2

--------------------------------

<*> Допускается приготовление среды без резазурина натрия.

Тиогликолевую среду можно хранить в течение 14 сут со дня

приготовления при температуре от 10 до 25 град. С в защищенном от

света месте.

В случае, если при хранении среды, содержащей резазурин,

верхний слой среды (более 1/3 объема) окрасится в розовый цвет,

среду можно регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в

течение 10-15 мин до исчезновения розовой окраски с последующим

быстрым охлаждением. В случае, если окраска не исчезает после

нагревания, среду считают непригодной к употреблению. Регенерацию

среды можно проводить только один раз.

Среда Сабуро:

пептона ферментативного 10 г

глюкозы 40 >>

воды дистиллированной до 1000 мл

рН после стерилизации 5,6 +/- 0,2

Обе среды стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении

0,11 +/-0,02 МПа (1,1 +/-0,2 кгс/кв. см) и при температуре (121

+/-1) град. С в течение 15 мин.

Жидкость N 1:

пептона ферментативного 1 г

воды дистиллированной до 1000 мл

рН после стерилизации 7,1 +/-0,2

Жидкость N 2:

пептона ферментативного 5 г

твина-80 10 г

воды дистиллированной до 1000 мл

рН после стерилизации 7,1 +/-0,2

Жидкости разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют так же, как

и питательные среды.

Требования к ростовым свойствам питательных сред.

Тиогликолевая среда и среда Сабуро должны обеспечивать визуально

обнаруживаемый рост соответствующих тест - штаммов аэробных и

анаэробных бактерий и грибов (предусмотренных НТД).

Используемые питательные среды должны обеспечивать рост

микроорганизмов при посеве их в количестве менее 100

жизнеспособных клеток: для тиогликолевой среды - не позднее 48 ч

инкубации при температуре от 30 до 35 град. С и для среды Сабуро -

не позднее 72 ч инкубации при температуре от 20 до 25 град. С.

ИСПЫТАНИЕ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЧИСТОТУ

Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, растворы,

экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе

производства, могут быть контаминированы микроорганизмами и

поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту.

Таблица 13

Тест - микроорганизмы, используемые для

определения антимикробного действия лекарственных

средств и ростовых свойств питательных сред

------------------T---------------------------------T------------

¦ N по Каталогу ¦ ¦ ¦

¦ штаммов ¦ ¦Питательная ¦

¦ Всесоюзного ¦ Тест - штаммы ¦ среда ¦

¦музея патогенных ¦ ¦ N ¦

¦бактерий ГИСК им.¦ ¦ ¦

¦ Л.А.Тарасевича ¦ ¦ ¦

+-----------------+---------------------------------+------------+

¦ 010011 ¦Bacillus subtilis ATCC 6633 ¦ 1 ¦

¦ 010014 ¦Bacillus cereus ATCC 10702 ¦ 1 ¦

¦ 240533 ¦Escherichia coli ATCC 25922 ¦ 3 ¦

¦ ¦ ¦ 6 ¦

¦ ¦ ¦ 7 ¦

¦ 190155 ¦Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ¦ 9 ¦

¦ 201108 ¦Staphylococcus aureus ATCC 6538-P¦ 10 ¦

¦ ¦ ¦ 8 ¦

+-----------------+---------------------------------+------------+

¦N в коллекции ¦ ¦ ¦

¦патогенных ¦ ¦ ¦

¦грибов НИО ¦ ¦ ¦

¦глубоких микозов ¦ ¦ ¦

¦Ленинградского ¦ ¦ ¦

¦ГИДУВ ¦ ¦ ¦

+-----------------+---------------------------------+------------+

¦ 259 ¦Candida albicans ATCC 885-653 ¦ 2 ¦

L-----------------+---------------------------------+-------------

Испытание на микробиологическую чистоту включает

количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а

также выявление определенных видов микроорганизмов, наличие

которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.

Испытание проводят в асептических условиях, применяя

приведенные методы и питательные среды для контроля всех видов

нестерильных лекарственных средств, а также сырья, используемого в

их производстве.

Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, и

консерванты, входящие в состав некоторых нестерильных

лекарственных средств, могут подавлять рост отдельных видов

микроорганизмов в условиях проведения испытания.

Во избежание неправильной оценки результатов испытания

определяют действие лекарственного средства в отношении следующих

тест - микроорганизмов: Bacillus subtilis (Bacillus cereus),

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Candida albicans, указанных в табл. 13.

Определение антимикробного действия лекарственного средства.

Пять образцов лекарственного средства по 1 г (мл) каждый разводят

в соотношении 1:10 фосфатным буферным раствором рН 7,0 (два

образца), средой N 3 (один образец) и средой N 8 (два образца).

Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus выращивают на

жидкой среде N 1 при температуре от 30 до 35 град. С в течение

18-20 ч, культуру Candida albicans - на жидкой среде N 2 при

температуре от 20 до 25 град. С в течение 48 ч. Культуры разводят

1:1000 стерильным 0,9% раствором натрия хлорида изотоническим,

вносят по 1 мл взвеси каждого тест - штамма (в отдельности) в

приготовленные образцы лекарственного средства в буферном растворе

(Bacillus subtilis, Candida albicans), в среде N 3 (Escherichia

coli) и в среде N 8 (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus). Для выявления микроорганизмов используют методы,

приведенные в данной статье. В случае отсутствия роста тест -

штаммов на соответствующих питательных средах отмечают

антимикробное действие лекарственного средства.

Для устранения антимикробного действия лекарственного средства

используют различные методы: 1) увеличивают разведение

лекарственного средства, взяв больший объем растворителя; 2)

добавляют необходимое количество соответствующего специфического

инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие

лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганизмов

(например, пенициллиназу - для пенициллинов и цефалоспоринов,

пара - аминобензойную кислоту - для сульфаниламидов); 3)

комбинируют методы 1 и 2; 4) вводят неспецифические инактиваторы в

питательные среды, нейтрализующие антимикробное действие

лекарственного средства (например, 4% твина-80, 0,5% соевого

лецитина); 5) если все вышеперечисленные методы неэффективны, а

лекарственное средство растворимо, используют метод мембранной

фильтрации; 6) если в связи с природой лекарственного средства

нельзя использовать метод мембранной фильтрации, а все

вышеперечисленные методы устранения его антимикробного действия в

отношении данного тест - штамма неэффективны, этот вид испытания

не проводят.

Отбор и приготовление проб лекарственных средств для

испытаний. От каждой серии лекарственного средства (независимо от

ее объема) отбирают среднюю пробу не менее 50 г (мл), состоящую из

равных разовых проб, взятых из минимум 10 разных упаковок. Для

одного анализа лекарственного средства используют отдельные

образцы по 10 г (мл) для каждого из описанных далее разделов

исследования. Всего для проведения одного анализа используют 30 г

(мл) лекарственного средства. В том случае, когда возникает

необходимость подтвердить несомненность результатов, проводят

повторное испытание только по данному разделу исследования,

используя образец в количестве 10 г (мл).

Для ряда лекарственных средств (антибиотиков, мягких

лекарственных форм и др.) отбирают от каждой серии среднюю пробу

не менее 15 г, состоящую из равных разовых проб, взятых из не

менее чем 10 разных упаковок. Для одного анализа используют

образцы по 3 г (мл) для каждого раздела исследования. Всего для

проведения одного анализа используют по 9 г (мл) лекарственного

средства. При повторении испытания по одному из разделов

исследования используют образец в количестве 3 г (мл).

Для лекарственных средств в аэрозольной упаковке, пленок

полимерных лекарственных и др. отбор и приготовление проб проводят

согласно указанию в частных статьях.

В зависимости от физических свойств лекарственной формы

образец для анализа готовят в виде раствора, суспензии или

эмульсии:

- твердые лекарственные формы, которые трудно растворяются,

измельчают с помощью соответствующего оборудования и суспендируют

в фосфатном буферном растворе рН 7,0 или соответствующей жидкой

питательной среде, рекомендованной для определенного вида

испытания;

- жидкие лекарственные формы, а также твердые формы, которые

быстро и практически полностью растворяются в фосфатном буферном

растворе рН 7,0 или соответствующей питательной среде в разведении

1:10, готовят в виде растворов или суспензий;

- мягкие лекарственные формы, нерастворимые в воде,

эмульгируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 с помощью

стеклянных бус и минимального количества подходящего стерильного

эмульгатора, указанного в соответствующей статье (например,

твин-80), применяя механическое встряхивание и нагревание до

температуры не более 45 град. С в случае необходимости.

Приготовленные разведения образцов используют для определения

общего числа бактерий и грибов в 1 г (мл) лекарственного средства

и установления отсутствия бактерий семейств Еnterobacteriaceae,

Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.

Количественное определение микроорганизмов

Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри

диаметром 90-100 мм. Образец лекарственного средства в количестве

10 г (мл) растворяют, суспендируют или эмульгируют в фосфатном

буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем раствора

(суспензии, эмульсии) был 100 мл. Посевы просматривают ежедневно.

Определение общего числа бактерий. Приготовленный раствор

(суспензию, эмульсию) образца вносят по 1 мл в каждую из двух

пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры от 45

до 50 град. С среды N 1. Быстро перемешивают содержимое пробирки и

переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной

среды N 1. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно

распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки

переворачивают и инкубируют в течение 5 сут при температуре от 30

до 35 град. С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают

число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее

значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число

бактерий в 1 г (мл) образца.

Для получения достоверных результатов учитывают только те

чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний. Если при

разведении образца 1:10 нет роста, результаты отмечают следующим

образом: "В 1 г (мл) лекарственного средства (сырья) менее 10

бактерий".

Если число колоний на чашке превышает 300, делают ряд

дальнейших последовательных разведений образца (1:100, 1:1000 и

т.д.), выбирая для посева разведение, наиболее соответствующее

указанному выше уровню.

Определение общего числа грибов. Испытание проводят

двухслойным агаровым методом, описанным выше, используя среду N 2.

Посевы инкубируют в течение 5 сут при температуре от 20 до 25

град. С. Через 72 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают общее

число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находят

среднее значение и, умножая его на показатель разведения, т.е. на

10, вычисляют число грибов в 1 г (мл) образца. В случае, если

число колоний грибов на чашке превышает 300, делают ряд дальнейших

разведений образца. На чашке учитывают все колонии грибов, даже

если их число менее 30.

ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ

СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE

Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной

среды N 3, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35

град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей

на среды N 4 и N 5, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при

температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч. Если после

инкубации на средах N 4 и N 5 не будет колоний, соответствующих

морфологической характеристике, данной в табл. 14, считают, что в

образце нет бактерий семейства Enterobacteriaceae.

Колонии, подозрительные по морфологии на принадлежность к

семейству Enterobacteriaceae, пересевают каждую отдельно со сред N

4 и N 5 на скошенную в пробирках среду N 1 и выращивают при

температуре от 30 до 35 град. С в течение 18-20 ч. Из каждой

пробирки с чистой культурой через сутки делают пересевы на среды N

6 и N 7. После посева в половину пробирок со средой N 6 вносят по

0,5 мл стерильного вазелинового масла. Все посевы инкубируют при

температуре от 30 до 35 град. С в течение 18-20 ч. При наличии

роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды N

6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него. О наличии

нитритов в среде N 7 судят по появлению красного окрашивания при

внесении в среду реактива Грисса. Параллельно исследуют чистые

культуры на наличие фермента цитохромоксидазы.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие

палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию,

ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и

восстанавливают нитраты в нитриты, лекарственное средство

контаминировано бактериями семейства Enterobacteriaceae.

Таблица 14

Морфологическая характеристика бактерий

семейства Enterobacteriaceae

на диагностических средах

-------------------T--------------------------T------------------

¦ Диагностическая ¦ N 4 ¦ N 5 ¦

¦ среда ¦ агар Эндо ¦висмутсульфит агар¦

+------------------+--------------------------+------------------+

¦Характерная ¦Колонии круглые, малиновые¦Черные колонии с¦

¦морфология колоний¦с металлическим блеском¦характерным метал-¦

¦ ¦или без него; розовые,¦лическим блеском,¦

¦ ¦бесцветные, блестящие,¦участки среды под¦

¦ ¦выпуклые диаметром 2-4 мм ¦колониями окрашены¦

¦ ¦ ¦в черный цвет; ¦

¦ ¦ ¦зеленовато - бурые¦

¦ ¦ ¦колонии, светло -¦

¦ ¦ ¦зеленые, бурые ¦

¦Окраска по Граму ¦Грамотрицательные неспорообразующие палочки ¦

L------------------+----------------------------------------------

ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ

PSEUDOMONAS AERUGINOSA И STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной

среды N 8, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35

град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей

на среды N 9 и N 10, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при

температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч.

Если после инкубации на средах N 9 и N 10 не обнаружены

колонии микроорганизмов, соответствующих морфологической

характеристике, данной в табл. 15 и 16, считают, что в

лекарственном средстве нет Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus

aureus. При наличии на среде N 9 характерных для Pseudomonas

aeruginosa колоний грамотрицательных неспорообразующих палочек,

обладающих специфическим запахом и выделяющих сине - зеленый

пигмент пиоцианин в питательный агар, культуру исследуют на

наличие фермента цитохромоксидазы.

Таблица 15

Морфологическая характеристика Pseudomonas

aeruginosa на диагностической среде N 9

---------------------------T-------------------------------------

¦ Характерная морфология ¦ Окраска по Граму ¦

¦ колоний ¦ ¦

+--------------------------+-------------------------------------+

¦Зеленоватые, как правило,¦Грамотрицательные неспорообразующие¦

¦флюоресцирующие колонии,¦палочки ¦

¦голубые в ультрафиолетовом¦ ¦

¦свете ¦ ¦

L--------------------------+--------------------------------------

Таблица 16

Морфологическая характеристика Staphylococcus

aureus на диагностической среде N 10

-----------------------T-----------------------------------------

¦Характерная морфология¦ Окраска по Граму ¦

¦ колоний ¦ ¦

+----------------------+-----------------------------------------+

¦Золотисто - желтые ко-¦Грамположительные кокки, расположенные¦

¦лонии, окруженные жел-¦гроздьями ¦

¦тыми зонами ¦ ¦

L----------------------+------------------------------------------

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие

палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию и образуют

сине - зеленый пигмент, лекарственное средство контаминировано

Pseudomonas aeruginosa.

Наличие на среде N 10 золотисто - желтых колоний

грамположительных кокков, окруженных желтыми зонами,

свидетельствует о ферментации маннита. Чистую культуру

стафилококка исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.

Если в образце обнаружены грамположительные кокки, которые

ферментируют маннит и дают положительную реакцию плазмокоагуляции,

лекарственное средство контаминировано Staphylococcus aureus.

В нестерильных лекарственных средствах не допускается наличие

бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и

Staphylococcus aureus.

В 1 г (мл) лекарственного средства для приема внутрь

допускается наличие не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и

плесневых грибов (суммарно).

В 1 г (мл) лекарственного средства для применения в полости

уха, носа, для интравагинального использования и для местного

употребления допускается наличие не более 100 микроорганизмов, в

том числе и грибов.

Тест на наличие нитритов. К суточной исследуемой культуре

бактерий на среде N 7 приливают 0,2-0,3 мл реактива Грисса,

погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания

свидетельствует о наличии нитритов.

Тест на наличие цитохромоксидазы. Полоску фильтровальной

бумаги смачивают реактивом и наносят платиновой петлей или

стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий

со скошенной среды N 1. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5

мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.

Тест на наличие плазмокоагулазы (реакция плазмокоагуляции).

Кровь, взятую стерильным шприцем из сердца кролика, помещают в 5%

стерильный раствор натрия цитрата, отсасывают плазму, разводят 1:5

0,9% стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают

по 0,5 мл в стерильные пробирки. В каждую пробирку помещают 1

петлю суточной культуры стафилококка и инкубируют при температуре

от 30 до 35 град. С в течение 4-6 ч. Если в течение этого времени

не наблюдают свертывание плазмы, реакцию плазмокоагуляции считают

отрицательной. Обязательно наличие двух контролей: 1) контроль

раствора плазмы, 2) контроль культуры стафилококка, обладающего

ферментом коагулазой.

Для удобства постановки реакции плазмокоагуляции можно

использовать сухую кроличью цитратную плазму промышленного

производства, которую разводят согласно наставлению по применению.

Питательные среды

Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие

определенных микроорганизмов. Готовить питательные среды следует,

строго придерживаясь приведенной рецептуры. Компоненты питательных

сред должны соответствовать ГОСТ и ТУ.

Состав и приготовление питательных сред. Среда N 1 - для

выращивания бактерий:

пептона ферментативного сухого 10 г

натрия хлорида 5 >>

глюкозы 1 >>

агара микробиологического <*> 13 >>

мясной воды (1:2) 1000 мл

рН после стерилизации 7,3 +/-0,2.

К мясной воде прибавляют пептон и натрия хлорид, растворяют

при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают рН, кипятят в

течение 1 мин, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до

полного его расплавления, фильтруют через ватно - марлевый фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением

при температуре 121 град. С в течение 15 мин.

Среда N 2 - для выращивания грибов (Сабуро):

пептона ферментативного сухого 10 г

глюкозы 40 >>

агара микробиологического <*> 13 >>

воды дистиллированной 1000 мл

рН после стерилизации 5,6 +/-0,2.

Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный

заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют

через ватно - марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе

насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в

течение 15 мин. Для подавления роста бактерий после стерилизации

насыщенным паром под давлением прибавляют 100 мг бензилпенициллина

и 100 мг тетрациклина (либо перед стерилизацией насыщенным паром

под давлением - 50 мг левомицетина) на 1000 мл среды.

--------------------------------

<*> Жидкие среды N 1 и N 2 не содержат агара.

Среда N 3 - среда обогащения для бактерий семейства

Enterobacteriaceae:

пептона ферментативного сухого 10,0 г

натрия фосфата двузамещенного 7,5 >>

калия фосфата однозамещенного 2,5 >>

глюкозы 10,0 >>

фенолового красного 0,08 >>

малахитового зеленого 0,015 >>

мясной воды (1:2) 1000 мл

рН после стерилизации 7,3 +/-0,2.

Пептон и соли растворяют в мясной воде при нагревании, вносят

глюкозу, прибавляют 8 мл 1% раствора фенолового красного и 3 мл

0,5% раствора малахитового зеленого, устанавливают рН, кипятят 1

мин, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют насыщенным паром

под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин в

паровом стерилизаторе.

Среда N 4 (агар Эндо сухой) -для выделения прописи семейства

Enterobacteriaceae - готовят согласно бактерий на этикетке.

Среда N 5 (висмутсульфит агар сухой) - для выделения бактерий

семейства Enterobacteriaceae - готовят согласно прописи на

этикетке.

Среда N 6 - для определения ферментации глюкозы:

пептона ферментативного сухого 10,0 г

натрия хлорида 5,0 >>

глюкозы 40,0 >>

фенолового красного 0,08 >>

мясной воды (1:2) 1000 мл

рН после стерилизации 7,2 +/-0,2.

Пептон и натрия хлорид растворяют в мясной воде при

нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 мл 1% раствора

фенолового красного, устанавливают рН, кипятят 1 мин, фильтруют

через бумажный фильтр и разливают в пробирки с поплавками по 4-5

мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под

давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. По

окончании стерилизации следует как можно быстрее охладить среду.

Среда N 7 - для определения восстановления нитратов в нитриты:

пептона ферментативного сухого 5,0 г

натрия хлорида 5,0 >>

калия нитрата 1,5 >>

воды дистиллированной 1000 мл

рН после стерилизации 7,2 +/-0,2.

Все компоненты растворяют в воде при нагревании, устанавливают

рН, кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в

пробирки по 4-5 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным

паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин.

Таблица 17

Тест - микроорганизмы и условия для биологического

определения активности антибиотиков

---------------T---------------T----------------T----------T-----------------

¦ ¦ ¦ Среда для ¦Количество¦ ¦

¦ ¦ ¦ определения ¦ среды на ¦ ¦

¦ ¦ ¦ активности ¦ каждую ¦ ¦

¦Антибиотик <1>¦Тест - микро- ¦ <3, 4> ¦ чашку, ¦ Посевная ¦

¦ ¦организмы <2> ¦ ¦ мл <5> ¦ доза <6> ¦

¦ ¦ +----T-----------+----T-----+ ¦

¦ ¦ ¦ниж-¦ верхний ¦ниж-¦верх-¦ ¦

¦ ¦ ¦ний ¦ лой ¦ний ¦ ний ¦ ¦

¦ ¦ ¦слой¦ ¦слой¦слой ¦ ¦

+--------------+---------------+----+-----------+----+-----+-----------------+

¦Ампициллин ¦Staphylococcus ¦N 11¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦40 млн микробных¦

¦ ¦aureus 209 Р ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦клеток на 1 мл¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Амфотерицин В ¦Candida utilis ¦ ¦N 16 + 0,1%¦ ¦ 15 ¦3 мл рабочей¦

¦ ¦ЛИА-01 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦взвеси на 100 мл¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Бензилпеницил-¦Staphylococcus ¦N 11¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦40 млн микробных¦

¦лин ¦aureus 209 Р ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦клеток на 1 мл¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Гелиомицин ¦Вас. subtilis ¦N 17¦ N 17 ¦ ¦ 15 ¦100 млн спор на 1¦

¦ ¦ATCC 6633 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Гентамицин ¦Вас. pumilus ¦ ¦ N 9 ¦ 20 ¦ 5 ¦50 млн спор на 1¦

¦ ¦NCTC 8241 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Грамицидин С ¦Вас.cereus ¦ ¦ N 13 ¦ ¦ 10 ¦8 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦537 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Дактиномицин ¦Вас. cereus, ¦ ¦ N 14 ¦ ¦ 10 ¦20 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦HB ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Дигидростреп- ¦Вас. cereus, ¦ ¦ N 9 ¦ ¦ 10 ¦20 млн спор на 1¦

¦томицин ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦537 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Диклоксациллин¦Staphylococcus ¦N 11¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦40 млн микробных¦

¦ ¦aureus ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦клеток на 1 мл¦

¦ ¦209 P ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Доксициклин ¦Вас. subtilis, ¦ ¦N 6 + 1% ¦ ¦ 10 ¦30 млн спор на 1¦

¦ ¦var Л2 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Канамицин В10 ¦Вас. subtilis ¦N 12¦ N 8 ¦ 10 ¦ 5 ¦100 млн спор на 1¦

¦ ¦ATCC 6633 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Канамицин ¦Вас. pumilus ¦N 8 ¦ N 8 ¦ 15 ¦ 5 ¦40 млн спор на 1¦

¦ ¦NCTC 8241 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Карбенициллин ¦Pseudomonas ¦ ¦ N 7 ¦ ¦ 15 ¦10 мл бульонной¦

¦ ¦aeruginosa ¦ ¦ ¦ ¦ ¦культуры на 100¦

¦ ¦NCTC 2134 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Карминомицин ¦Вас. cereus, ¦ ¦ N 5 ¦ ¦ 15 ¦100 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦537 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Леворин ¦Candida utilis ¦ ¦N 16 + 1% ¦ ¦ 15 ¦2-2,5 мл рабочей¦

¦ ¦ЛИА-01 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦взвеси на 100 мл¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Линкомицин ¦Вас. subtilis ¦ ¦ N 8 ¦ ¦ 10 ¦100 млн спор на 1¦

¦ ¦ATCC 6633 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Метациклин ¦Вас. subtilis, ¦ ¦N 6 + 1% ¦ ¦ 10 ¦30 млн спор на 1¦

¦ ¦var. Л2 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Метициллин ¦Staphylococcus ¦ ¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦40 млн микробных¦

¦ ¦N 11 aureus ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦клеток на 1 мл¦

¦ ¦209 P ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Микогептин ¦Candida utilis ¦ ¦N 16 + 1% ¦ ¦ 15 ¦2,5-3 мл рабочей¦

¦ ¦ЛИА-01 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦взвеси на 100 мл ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Мономицин ¦Вас. cereus, ¦ ¦ N 9 ¦ ¦ 10 ¦20 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦537 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Неомицин ¦То же ¦N 9 ¦ ¦ 20 ¦ 5 ¦20 млн спор на 1¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Нистатин ¦Candida utilis ¦ ¦N 16 + 1% ¦ ¦ 15 ¦3-3,5 мл рабочей¦

¦ ¦ЛИА-01 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦взвеси на 100 мл¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Оксациллин ¦Staphylococcus ¦N 11¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦40 млн микробных¦

¦ ¦aureus 209 Р ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦клеток на 1 мл¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Окситетра- ¦Вас. subtilis ¦ ¦N 6 + 1% ¦ ¦ 10 ¦30 млн спор на 1¦

¦циклин ¦var. Л2 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Олеандомицин ¦Вас. cereus, ¦ ¦ N 9 ¦ ¦ 10 ¦20 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦HB ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Оливомицин ¦Вас. subtilis ¦N 11¦ N 18 ¦ 10 ¦ 5 ¦10 млн спор на 1¦

¦ ¦АТСС 6633 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Полимиксин В ¦Bordetella ¦ ¦ N 15 ¦ ¦ 10 ¦40-60 млн микроб-¦

¦ ¦bronchiseptica ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ных клеток на 1¦

¦ ¦АТСС 4617 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Полимиксин М ¦Bordetella ¦ ¦ N 15 ¦ ¦ 10 ¦40-60 млн микроб-¦

¦ ¦bronchiseptica ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ных клеток на 1¦

¦ ¦АТСС 4617 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Рифампицин ¦Вас. subtilis ¦ ¦N 10 + 0,1%¦ ¦ 10 ¦40 млн спор на 1¦

¦ ¦АТСС 6633 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Рубомицин ¦Вас. cereus, ¦ ¦ N 5 ¦ ¦ 15 ¦10 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦537 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Сизомицин ¦Вас. pumilus ¦N 12¦ N 8 ¦ 20 ¦ 5 ¦50 млн спор на 1¦

¦ ¦NCTC 8241 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Стрептомицин ¦Вас. cereus, ¦ ¦ N 9 ¦ ¦ 10 ¦20 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦537 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Тетрациклин ¦Вас. subtilis ¦ ¦N 6 + 1% ¦ ¦ 10 ¦30 млн спор на 1¦

¦ ¦var Л2 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Феноксиметил- ¦Staphylococcus ¦N 11¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦40 млн микробных¦

¦пенициллин ¦aureus 209 P ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦клеток на 1 мл¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦среды ¦

¦Флоримицин ¦Вас. subtilis ¦ ¦ N 8 ¦ ¦ 10 ¦20 млн спор на 1¦

¦ ¦ATCC 6633 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Фузидин ¦Вас. cereus, ¦ ¦N 10 + 1% ¦ ¦ 10 ¦50 млн спор на 1¦

¦ ¦var. mycoides ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦ ¦HB ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦Цефалексин ¦Вас. subtilis ¦N 11¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦100 млн спор на 1¦

¦ ¦ATCC 6633 ¦ ¦глюкозы ¦ ¦ ¦мл среды ¦

¦Цефалотин ¦Вас. subtilis ¦N 11¦N 7 + 0,1% ¦ 10 ¦ 5 ¦40 млн спор н

Date: 2015-07-01; view: 891; Нарушение авторских прав