Определение биологической активности инсулина

Активность испытуемого препарата инсулина определяют путем

сопоставления его гипогликемического (сахаропонижающего) действия

с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина.

Стандартный образец и единица действия инсулина

Стандартный образец инсулина представляет собой препарат

высокоочищенного инсулина, активность которого определена путем

многократного сопоставления с активностью международного стандарта

и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За единицу действия (ЕД)

принимают специфическую активность количества массы стандартного

образца, эквивалентного по биологическому действию 1 международной

единице инсулина.

Примечание. Приготовление растворов стандартного образца и

испытуемого препарата инсулина. Точную навеску стандартного

образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты

(0,003 моль/л) с рН 2,7-3,0, содержащем консервант в такой же

концентрации, как испытуемый препарат.

Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина

4 мес при температуре 4 град. С.

Перед опытом основной раствор стандартного образца инсулина

разводят раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) до

концентрации 1 ЕД в 1 мл. Испытуемый препарат инсулина разводят

этим же раствором хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД

в 1 мл, исходя из его предполагаемой активности.

Метод определения биологической активности

Определение биологической активности инсулина проводят на

здоровых кроликах массой 2,5-3,5 кг. Животных массой 1,8-2,3 кг

предварительно не менее 14 сут содержат в условиях вивария, где

они получают овес, сено или свежую траву, корнеплоды,

комбинированный корм и воду. По истечении этого срока определяют

чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроликам дважды с

интервалом 7-8 сут после 18 ч голодания вводят подкожно раствор

стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела

животного и определяют величину снижения концентрации сахара в

крови в процентах. Кровь для исследования берут из краевой вены

уха животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5 ч после его

введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из

двух определений после введения инсулина). Кровь берут в условиях,

не допускающих чрезмерного волнения кроликов. Из опытов исключают

животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше

пределов, установленных для используемого метода определения

содержания сахара в крови (ниже 75 мг % и выше 120 мг % для

феррицианидного метода, ниже 52 мг % и выше 94 мг % для

глюкозооксидазного метода), а также тех животных, которые

реагируют на введение инсулина судорогами или у которых снижение

концентрации сахара в крови составляет менее 15% по отношению к

исходной концентрации. Определение биологической активности

инсулина проводят не ранее чем через 7-8 сут после испытания на

чувствительность.

Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18

ч, предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две

группы способом случайного выбора (в каждой группе должно быть не

менее 9 кроликов). Непосредственно перед введением инсулина

кроликов взвешивают, и определяют исходную концентрацию сахара в

крови. Кроликам одной группы вводят подкожно по 0,5 ЕД

стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам

другой группы - такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т).

Через 1,5 и 2,5 ч после введения инсулина у животных снова

определяют концентрацию сахара в крови.

Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара

(X) в крови в процентах по формуле:

а - b

Х = ------- х 100,

а

где а - исходная концентрация сахара в крови в миллиграмм -

процентах; b - средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм -

процентах из двух определений, проведенных через 1,5 и 2,5 ч после

введения инсулина.

Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсулину,

при расчетах не учитывают животных с исходной концентрацией сахара

в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого

метода, а также реагирующих на указанную дозу инсулина судорогами

или дающих снижение концентрации сахара в крови менее 15 % по

отношению к исходной концентрации.

Через 3-5 сут на этих же кроликах проводят повторное испытание

с той разницей, что животным из группы, получавшей стандартный

образец инсулина (S), вводят испытуемый препарат инсулина (Т), а

животным группы, получавшей (Т), вводят (S).

Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в

крови на стандартный образец (%S) и на испытуемый препарат (%Т) по

данным всего опыта. Отношение %T / %S выражает относительную

активность (R) испытуемого препарата (Т). Для выражения активности

испытуемого препарата (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А)

умножают на R: Т = R х A.

Пример: при определении биологической активности инсулина для

инъекций с предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл получили

следующие величины снижения концентрации сахара в крови в

процентах (Y).

Первая часть испытания Вторая часть испытания

Ys Yт Yт Ys

49 48 50 50

61 50 58 51

35 48,5 53 41

55 65 55 55

39 46 39 45

28 22,5 68 60

53 15 38 43

38 48 44 60

50 63 44 56

SUM Ys = 869; %S = ----- = 48,28.

%Т 45,83

R = ----- = ------ = 0,949.

%S 48,28

SUM Yт = 825; %Т = ----- = 45,83.

Активность Т в ЕД, по данным этого опыта, равна:

Т = 0,949 х 40 = 37,96 ЕД в 1 мл.

Определение проводят не менее 2 раз с каждым испытуемым

образцом (Т). Среднюю величину при этом получают, объединяя

индивидуальные цифры снижения концентрации сахара в крови в

процентах в обоих опытах. При расчете окончательного результата

должны быть использованы данные, полученные не менее чем на 30

кроликах. Если средняя величина R, по данным двух или большего

числа опытов, будет меньше 0,85 или больше 1,15, испытание

проводят заново, исходя из новой величины предполагаемой

активности испытуемого препарата.

Кролики могут быть использованы повторно для определения

биологической активности не ранее чем через 2 нед после окончания

предшествующего опыта. Продолжительность использования кроликов в

опытах по определению биологической активности инсулина не должна

превышать 5 мес.

Определение содержания сахара (глюкозы) в крови

Содержание сахара (глюкозы) в крови при определении

биологической активности инсулина чаще всего проводят

феррицианидным (метод Хагедорна - Йенсена) или глюкозооксидазным

методом, однако возможно применение и других методов.

Рекомендуется использование готовых наборов реактивов и

автоматизированных приемов, в частности автоматических аппаратов

для определения сахара (глюкозы) в крови.

Феррицианидный метод (метод Хагедорна - Йенсена). К 5 мл 0,45%

раствора цинка сульфата в пробирке прибавляют 1 мл раствора натра

едкого (0,1 моль/л) и затем 0,1 мл крови. Пробирку помещают на 5

мин в кипящую водяную баню, после чего смесь фильтруют в колбу для

титрования через воронку с ватой (специально приготовленной).

Пробирку дважды промывают 3 мл воды. Промывные воды присоединяют к

фильтрату. К фильтрату прибавляют 2 мл раствора калия феррицианида

(красной кровяной соли, 0,005 моль/л), смесь помещают в кипящую

водяную баню на 20 мин, затем охлаждают в холодной воде. К смеси

прибавляют 3 мл хлорцинкйодистого ("тройного") раствора, 3 мл 3%

раствора уксусной кислоты и 2 капли 1% раствора крахмала.

Освободившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата (0,005

моль/л). Параллельно титруют контрольную пробу (не содержащую

крови), обработанную теми же реактивами.

Количество натрия тиосульфата, пошедшего на титрование,

зависит от концентрации сахара в крови. Эту концентрацию

рассчитывают с помощью табл. 11, составленной для раствора натрия

тиосульфата (0,005 моль/л), пошедшего на титрование сахара в

пробе. В первом вертикальном столбце указаны целые и десятые, а в

верхнем горизонтальном ряду - сотые доли миллилитра раствора

натрия тиосульфата. На пересечении этих двух рядов находят цифру,

выражающую концентрацию сахара (мг %) в титруемой пробе. Из

опытной пробы вычитают контрольную пробу и получают окончательную

величину содержания сахара в крови кролика.

Таблица 11

Расчет содержания сахара в миллиграммах в 0,1 мл

крови при использовании 0,005 моль/л

раствора натрия тиосульфата (феррицианидный метод)

------T-----------------------------------------------------------

¦Тио- ¦ Сотые доли миллилитра тиосульфата ¦

¦суль-+-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+

¦фат, ¦0,00 ¦0,01 ¦0,02 ¦0,03 ¦0,04 ¦0,05 ¦0,06 ¦0,07 ¦0,08 ¦0,09 ¦

¦мл ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦0,0 ¦0,385¦0,382¦0,379¦0,376¦0,373¦0,370¦0,366¦0,364¦0,361¦0,358¦

¦0,1 ¦0,355¦0,352¦0,350¦0,348¦0,345¦0,343¦0,341¦0,338¦0,336¦0,333¦

¦0,2 ¦0,331¦0,329¦0,327¦0,325¦0,323¦0,321¦0,318¦0,316¦0,314¦0,312¦

¦0,3 ¦0,310¦0,308¦0,306¦0,304¦0,302¦0,300¦0,298¦0,296¦0,294¦0,292¦

¦0,4 ¦0,290¦0,288¦0,286¦0,284¦0,282¦0,280¦0,278¦0,276¦0,274¦0,272¦

¦0,5 ¦0,270¦0,268¦0,266¦0,264¦0,262¦0,260¦0,259¦0,257¦0,255¦0,253¦

¦0,6 ¦0,251¦0,249¦0,247¦0,245¦0,243¦0,241¦0,240¦0,238¦0,236¦0,234¦

¦0,7 ¦0,232¦0,230¦0,228¦0,226¦0,224¦0,222¦0,221¦0,219¦0,217¦0,215¦

¦0,8 ¦0,213¦0,211¦0,209¦0,208¦0,206¦0,204¦0,202¦0,200¦0,199¦0,197¦

¦0,9 ¦0,195¦0,193¦0,191¦0,190¦0,188¦0,186¦0,184¦0,182¦0,181¦0,179¦

¦1,0 ¦0,177¦0,175¦0,173¦0,172¦0,170¦0,168¦0,166¦0,164¦0,163¦0,161¦

¦1,1 ¦0,159¦0,157¦0,155¦0,154¦0,152¦0,150¦0,148¦0,146¦0,145¦0,143¦

¦1,2 ¦0,141¦0,139¦0,138¦0,136¦0,134¦0,132¦0,131¦0,129¦0,127¦0,125¦

¦1,3 ¦0,124¦0,122¦0,120¦0,119¦0,117¦0,115¦0,113¦0,111¦0,110¦0,108¦

¦1,4 ¦0,106¦0,104¦0,102¦0,101¦0,099¦0,097¦0,095¦0,093¦0,092¦0,090¦

¦1,5 ¦0,088¦0,086¦0,084¦0,083¦0,081¦0,079¦0,077¦0,075¦0,074¦0,072¦

¦1,6 ¦0,070¦0,068¦0,066¦0,065¦0,063¦0,061¦0,059¦0,057¦0,056¦0,054¦

¦1,7 ¦0,052¦0,050¦0,048¦0,047¦0,045¦0,043¦0,041¦0,039¦0,038¦0,036¦

¦1,8 ¦0,034¦0,032¦0,031¦0,029¦0,027¦0,025¦0,024¦0,022¦0,020¦0,019¦

¦1,9 ¦0,017¦0,015¦0,014¦0,012¦0,010¦0,008¦0,007¦0,005¦0,003¦0,002¦

L-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------

Примечания. 1. Приготовление 0,45% раствора цинка сульфата.

4,5 г цинка сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью

1 л и доводят объем раствора водой до метки. Срок годности

раствора 7-10 сут.

2. Приготовление хлорцинкйодистого ("тройного") раствора: 5 г

цинка сульфата и 2,5 г калия йодида растворяют в 100 мл

насыщенного раствора натрия хлорида. Раствор должен быть

свежеприготовленным.

3. Приготовление раствора натрия тиосульфата (0,005 моль/л):

25 г натрия тиосульфата помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и

растворяют в свежепрокипяченной и охлажденной до комнатной

температуры воде. Объем раствора в колбе доводят водой до метки.

Выдерживают 10 сут в защищенном от света месте. Перед

употреблением полученный раствор разводят водой в 20 раз, для чего

25 мл раствора помещают в мерную колбу вместимостью 0,5 л, доводят

водой до метки и тщательно взбалтывают. Титр полученного раствора

устанавливают с помощью раствора калия йодата (0,005 моль/л). Если

раствор натрия тиосульфата оказывается менее концентрированным,

чем 0,005 моль/л, то по каплям прибавляют основной раствор

тиосульфата. Если раствор более концентрированный, то прибавляют

воду и добиваются, чтобы окончательный раствор был точно 0,005

моль/л (для удобства подсчета).

4. Приготовление раствора калия йодата (0,005 моль/л). 0,1782

г калия йодата, предварительно высушенного до постоянной массы,

растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л.

5. Приготовление раствора калия феррицианида (0,005 моль/л):

1,65 г калия феррицианида растворяют в небольшом количестве воды в

мерной колбе вместимостью 1 л, затем прибавляют 10,6 г натрия

карбоната безводного (ГОСТ 83-79, х. ч.), растворяют и доводят

объем раствора водой до метки. Срок годности раствора 2 мес при

хранении в темном месте.

6. Приготовление 1% раствора крахмала: 1 г крахмала

растворимого по ГОСТ 10163-76 растворяют в 100 мл кипящего

насыщенного раствора натрия хлорида и фильтруют через вату. Срок

годности раствора 4 мес при хранении при комнатной температуре.

7. Приготовление ваты: вату (ГОСТ 5556-75) дважды кипятят в

воде, промывают холодной водой и сушат. Перед употреблением

смачивают водой.

Глюкозооксидазный метод. Кровь в количестве 0,1 мл смешивается

с 1,1 мл 0,9% изотонического раствора натрия хлорида в

центрифужной пробирке. Прибавляют 0,4 мл 5% раствора цинка

сульфата и 0,4 мл раствора натра едкого (0,3 моль/л). Перемешивают

и через 10 мин центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин. К

1 мл надосадочной жидкости прибавляют 3 мл энзимо - хромогенного

реактива, перемешивают и точно через 20 мин измеряют оптическую

плотность раствора в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны

625 нм против контрольной пробы, где вместо надосадочной жидкости

взята вода. Время с момента прибавления энзимо - хромогенного

реактива до измерения оптической плотности должно быть одинаковым

для всех проб. Параллельно проводят определение оптической

плотности раствора стандартного образца глюкозы с концентрацией

100 мг%.

Содержание глюкозы в пробе (X) рассчитывают по формуле:

Dx

Х = ----- С

Dст

где Dx - оптическая плотность испытуемой пробы; Dст - оптическая

плотность раствора стандартного образца глюкозы; С - концентрация

глюкозы в растворе стандартного образца.

Примечания. 1. Приготовление 5% раствора цинка сульфата: 50 г

цинка сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и

доводят объем раствора водой до метки. Срок годности раствора 7-10

сут.

2. Приготовление энзимо - хромогенного реактива: в мерную

колбу вместимостью 100 мл помещают 80-90 мл ацетатного буфера

(0,25 моль/л, рН 4,8), в котором растворяют 2 мг глюкозооксидазы

(ТУ 6-09- 10-1382-79), а затем 1 мг пероксидазы (фирмы "Реанал",

ВНР), прибавляют 1 мл 1% раствора о-толидина и доводят объем

раствора ацетатным буфером до метки. Срок годности реактива 3-4

нед. при хранении в защищенном от света месте при температуре от 8

до 10 град. С.

3. Приготовление раствора ацетатного буфера (0,25 моль/л, рН

4,8): раствор натрия ацетата (0,25 моль/л) смешивают с раствором

уксусной кислоты (0,25 моль/л) в соотношении 6:4. Срок годности

раствора 1 мес при хранении при температуре от 8 до 10 град. С.

4. Приготовление раствора натрия ацетата (0,25 моль/л): 17 г

натрия ацетата растворяют в небольшом количестве воды в мерной

колбе вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой до метки.

5. Приготовление раствора уксусной кислоты (0,25 моль/л): в

мерную колбу вместимостью 500 мл наливают небольшое количество

воды, прибавляют 7,75 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем

раствора водой до метки.

6. Приготовление раствора натра едкого (0,3 моль/л): 12 г

натра едкого растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и

доводят объем раствора водой до метки.

7. Приготовление 1% раствора о - толидина в абсолютном спирте:

1 г о - толидина (ТУ 60911-788-76), свежеперекристаллизованного из

спирта, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют в

небольшом количестве абсолютного спирта при взбалтывании и

подогревании на кипящей водяной бане. После охлаждения доводят

объем раствора абсолютным спиртом до метки. Срок годности раствора

4 мес при хранении в защищенном от света месте при температуре от

8 до 10 град. С.

8. Перекристаллизация о - толидина: готовят насыщенный раствор

о - толидина в горячем абсолютном спирте при нагревании на кипящей

водяной бане. Фильтруют раствор через складчатый фильтр на воронке

для горячего фильтрования. Фильтрат охлаждают и приливают избыток

охлажденной воды. Выпавшие кристаллы о - толидина быстро

отсасывают на воронке Бюхнера и высушивают в вакуум - эксикаторе

над кальция хлоридом.

9. Приготовление раствора стандартного образца глюкозы (5

мг/мл): 0,5 г глюкозы, предварительно высушенной до постоянной

массы при температуре 37 град. С, растворяют в насыщенном растворе

бензойной кислоты в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят

объем раствора до метки раствором бензойной кислоты. Срок годности

раствора 3 мес при температуре от 8 до 10 град. С.

10. Приготовление насыщенного раствора бензойной кислоты: 0,1

г бензойной кислоты (ГОСТ 10521-78) растворяют при нагревании до

60-70 град. С до полного растворения в воде в мерной колбе

вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. Срок

годности раствора 1 год.

ИСПЫТАНИЕ НА ПРОЛОНГИРОВАННОЕ (УДЛИНЕННОЕ)