Методы «мокрой» химии

Методы, основанные на определении восстанавливающих свойств глюкозы. Глюкоза является основным восстановителем в крови, ее удельный вклад в восстанавливающие свойства крови составляет около 80 %. В основе этих методов лежит положение, что на основе восстанавливающих свойств можно судить о содержании глюкозы в биологической пробе. Так как реально не только глюкоза биопроб обладает восстанавливающими свойствами, к тому же интерферирующие вещества наиболее активно появляются в критических ситуациях, то метод не удовлетворяет современным критериям правильности. Поэтому в настоящее время от этих методов практически повсеместно отказались. Только в некоторых лабораториях еще проводят качественную реакцию на глюкозу в моче с реактивом Гайнеса.

Колориметрические методы. Они основаны на способности глюкозы образовывать цветной комплекс с различными соединениями. Наиболее распространенным в недалеком прошлом был ортотолуидиновый метод, в котором глюкоза образует с орто-толуидином в кислой среде при нагревании продукт сине-зеленой окраски. Основные недостатки метода связаны с методическими неудобствами, низкой специфичностью, а также аллергизацией персонала и появившимися сообщениями о канцерогенном эффекте ортотолуидина.

Энзиматические методы. В КДЛ в основном используют 2 метода - глюкозоксидазный и гексокиназный.

Глюкозоксидазный метод основан на окислении глюкозы кислородом в присутствии фермента глюкозоксидазы, образуется перекись водорода, которая в присутствии пероксидазы окисляет хромоген, при этом скорость изменения оптической плотности раствора пропорциональна количеству глюкозы в биопробе.

глюкозоксидаза

Глюкоза + О₂ глюколактон + Н₂О₂

пероксидаза

Н₂О₂ + восстановленный хромоген Н₂О + окисленный хромоген

Наиболее распространенным является метод Триндера, в котором в качестве хромогена используется 4-аминофеназон с фенолом или замещающими его соединениями.

Определение глюкозы глюкозоксидазным методом можно проводить в любой биологической жидкости, на фотометре с термостатированием и регистрацией кинетики изменения оптической плотности пробы или на биохимическом анализаторе. Антикоагулянты гепарин, ЭДТА, оксалат натрия, цитрат, стабилизаторы фторид и монойодацетат практически не влияют на результаты. Недостатком метода является то, что перекись водорода, образующаяся в этой реакции, может окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом доля Н₂О₂, окисляющая хромоген, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе.

Гексокиназный метод основан на 2 сопряженных реакциях:

Реакция регистрируется при 340 нм по образованию НАДФН (тест Варбурга). Этот метод высокоспецифичен и не дает реакций с другими компонентами сыворотки или крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы.

Экспресс-методы с использованием диагностических тест-полосок («сухая химия»)

Повсеместное внедрение диагностических тест-полосок для полуколичественного определения метаболитов крови и мочи позволяет проводить анализ быстро, в присутствии пациента, непосредственно в приемном отделении, в палате, в домашних условиях. Дешевизна и простота процедуры позволяют обеспечить реагентными тест-полосками массовое (диспансерное) исследование различных групп населения. Все виды измерений могут быть выполнены с помощью как монофункциональных, так и полифункциональных полосок с различной комбинацией реагентных зон, что дает возможность проводить как комплексные, так и отдельные исследования.

Определение глюкозы в крови с помощью тест-полосок ФАН (производство ПЛИВА- Лахема, а.с., Чешская Республика).

МЕЛЛИФАН - диагностические тест-полоски для быстрого полуколичественного определения глюкозы в крови в общей клинической практике или для самоконтроля гликемии в домашних условиях. Самоконтроль за содержанием глюкозы в крови, регулярно проводимый больными сахарным диабетом, не исключает и не заменяет постоянного медицинского контроля, однако может существенно облегчить врачу наблюдение за состоянием больного.

Принцип действия полосок МеллиФАН основан на использовании высокоспецифичных сопряженных ферментативных реакций, катализируемых глюкозоксидазой и пероксидазой. Полоски содержат 2 индикаторные зоны, различающиеся используемыми хромогенами. Первая зона индикации содержит индикатор бензидинового типа, дающий в присутствии глюкозы синее окрашивание. Вторая зона содержит хромогенную систему, которая в присутствии глюкозы дает оранжево-красное окрашивание.

Определение глюкозы в крови с помощью глюкометров. В настоящее время широко выпускаются 2 типа глюкометров для экспресс-определения глюкозы в крови - отражательные фотометры и потенциометры.

Отражательные фотометры: существует несколько поколений тест-полосок для отражательных фотометров. В основе метода лежит глюкозоксидазная реакция, в результате которой меняется цвет индикатора диагностической полоски. Измерение проводится после внесения тест-полоски в измерительную камеру, работающую на принципе отражательного фотометра. При таком способе необходимо, как правило, удалять каплю крови с полоски, заполнять полоску четко дозированной по объему каплей крови, вносить пробу в камеру прибора.

Потенциометры или амперометры - измеряют ток, возникающий в результате восстановления перекиси водорода на электрохимическом элементе. Перекись водорода образуется в ходе высокоспецифичной глюкозоксидазной реакции. Примером такого типа глюкометра является предлагаемая фирмой ПЛИВА-Лахема система СЕНЗОРИ тест - глюкометр и тест-полоски. В этом случае зона тест-полоски, на которую наносится кровь, не вводится в измерительную ячейку, капля крови наносится на полоску без дозирования, измерение глюкозы проводится по максимуму производной тока, возникающего в электрохимической ячейке при протекании глюкозоксидазной реакции. Прибор работает на принципе сенсорной технологии, прост в эксплуатации, дает надежные результаты, память прибора сохраняет 180 величин.

Многочисленные сравнительные исследования и клинические испытания свидетельствуют, что экспресс-методы определения глюкозы в крови дают достаточно надежные результаты. Тем не менее, рекомендуется использовать повторное определение глюкозы в крови методами “мокрой химии” в тех случаях, когда тесты “сухой” химии выявили снижение уровня глюкозы ниже 2,8 ммоль/л или превышение уровня 25 ммоль/л, а также при гематокрите < 25 % и > 55 %.

Определение глюкозы в моче с помощью тест-полосок ФАН (производство ПЛИВА-Лахема а.с., Чешская Республика).

ГЛЮКОФАН - диагностическая полоска для исследования глюкозы в моче. Зона индикации содержит ферменты глюкозоксидазу и пероксидазу со специальной хромогенной системой, которая в присутствии глюкозы окисляется с образованием продуктов красного цвета. Проба на глюкозу реагирует возникновением ярко оранжевой окраски на концентрацию 2ммоль/л. Концентрация 1,7 ммоль/л в первой утренней порции мочи принята за верхний предел физиологической глюкозурии. Тест является высоко специфичным для глюкозы. Присутствие других сахаров не дает положительных результатов.

Тест-зоны полосок для специальных исследований у больных сахарным диабетом.

Кетоновые тела (ацетоуксусная кислота и ацетон) в моче определяются с помощью полосок КетоФАН или полифункциональных полосок ФАН. Обнаружение кетоновых тел в моче позволяет диагностировать метаболическую декомпенсацию у больных диабетом. Кома и предкоматозное состояние практически всегда сопровождаются кетоацидозом и кетонурией (за исключением гиперосмолярной комы). У пациентов с нераспознанным сахарным диабетом I типа кетоацидоз может развиться внезапно. Если больной получает недостаточные дозы инсулина, кетоацидоз постепенно прогрессирует.

Белок в моче определяют с помощью полосок АльбуФАН или полифункциональных полосок ФАН. Тест высокочувствителен к альбумину, мало к другим белкам. Наличие белка в моче частый, но неспецифический симптом при почечных заболеваниях. У пациентов с сахарным диабетом и гипертензией часто развивается манифестная протеинурия, которая без соответствующего лечения прогрессирует в почечную недостаточность. Тест, в первую очередь, направлен на выявление нарушений клубочковой фильтрации и не идентифицирует нарушение тубулярной реабсорбции. Для исследования рекомендуется использовать первую утреннюю порцию мочи.

Аскорбиновая кислота в моче определяется с помощью полосок ДекаФАН аско. Она является сильным восстановителем. Реакция полосок специфична не только для аскорбиновой кислоты, но и для сильно восстанавливающих веществ в моче, в частности, для метаболитов аспирина. Положительная реакция этой тест-зоны должна настораживать врача по поводу результатов исследования глюкозы, так как большое количество восстанавливающих веществ способно уменьшить окрашивание тест зоны на глюкозу, поэтому исследование необходимо повторить через 2-3 дня после последнего приема витамина С, салицилатов

Удельный вес мочи зависит не только от потребления жидкости, но и от развития патологии почек, в частности диабетической нефропатии. В норме у здоровых людей удельный вес мочи может колебаться от 1,000 до 1,040 г/л. Выраженное снижение удельного веса мочи из-за нарушения концентрирующей способности почек может развиться при диабетической нефропатии. Для получения информации о концентрирующей сособности почек нужно исследовать первую порцию утренней мочи, в которой удельный вес должен быть > 1.020 г/л. При этом важно, чтобы пациент соблюдал ограничение в потреблении жидкости накануне.

Нитриты – тест, свидетельствующий о наличии в моче нитрит-образующих бактерий. У больных моча из-за присутствия в ней глюкозы является хорошей средой для бактериальной флоры, поэтому сахарный диабет является группой высокого риска по развитию асимптоматических инфекций мочевыводящих путей и хронического пиелонефрита. Даже после завершения лечения инфекции мочевыводящих путей периодические исследования необходимо продолжать с целью своевременного обнаружения рецидива. Проведение теста и оценка результатов могут проводиться пациентами самостоятельно.

Лейкоцитурия – повышенная экскреция лейкоцитов с мочой – показатель воспаления почек и/или мочевывдящих путей. При хроническом воспалении и при лечении лейкоцитурия – более надежный симптом, чем нитритный тест на бактериурию.

Полифункциональные тест-полоски ФАН для исследования мочи (производство ПЛИВА-Лахема,а.с., Чешская республика).

Полифункциональные полоски предназначены для рационализации и ускорения исследования мочи, с их помощью при одном погружении в мочу могут быть получены 2 - 10 показателей биохимических параметров мочи. В полосках зоны индикации подобраны так, чтобы полоски служили для выявления определенного типа функциональных нарушений и заболеваний.

полоски служили для выявления определенного типа функциональных нарушений и заболеваний.

ДИАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы и кетоновых тел. Полоски специально предназначены для массового обследования населения с целью выявления сахарного диабета.

ТРИФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка и кислотности (рН);

ТЕТРАФАН ДИА - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов и рН;

НЕФРОФАН ЛЕЙКО – диагностические полоски для исследования нитритов, рН, белка, лейкоцитов, крови;

ПЕНТАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови и рН;

ГЕКСАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, уробилиногена и рН;

ГЕПТАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, билирубина, уробилиногена и рН;

ОКТАФАН – диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, рН, билирубина, уробилиногена, лейкоцитов;

НОНАФАН СГ - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, нитритов, билирубина, уробилиногена, рН и удельного веса;

ДЕКАФАН ЛЕЙКО – диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, нитритов, билирубина, уробилиногена, рН, удельного веса, лейкоцитов;

ДЕКАФАН АСКО - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, нитритов, билирубина, уробилиногена, рН, удельного веса, аскорбиновой кислоты.