Определение 1,4-бензодиазепинов после гидролиза.

Для проведения гидролиза м. б. исп-ваны ткани органов, хлороформные экстракты из подкисленных вытяжек и элюаты при применении сорбционного метода. Определенный объем элюата или экстракта выпаривают досуха. К сухому остатку, навеске ткани органа, к 10 мл мочи или 2 мл крови прибавляют 2 мл 6 М р-ра хлоровод. к-ты. Смесь нагревают на кипящей вод. бане в теч. 1 ч или 5-10 мин на глицериновой (песчаной) бане при 120°С. При наличии в объекте производных 1,4-бензодиазепина р-р окраш-я в желт. цв. за счет образования бензофенонов.

Продукт гидролиза диазепама не образует азокрасителя, т. к. имеет заместитель - метильную группу в полож. 1. В присутствии диазепама р-р может сохранить желт. окр.

Вторую часть гидролизата осторожно подщелачивают 50% р-ром NaOH до рН=10-11 и экстрагируют гексаном. Гексановые экстракты выпаривают досуха при комн. т-ре, остаток раств-ют в небольш. объеме этанола и исследуют с помощью ТСХ- и УФ-спектрофотометрии.

Хр-графию проводят на пластинках «Силуфол». Подвижная фаза: бензол, к-м предварительно насыщают хроматографическую камеру в теч. 10 мин. Р-р экстракта из гидролизата наносят на стартовую линию пластинки и одновременно в кач-ве «свидетелей» - бензофеноны, полученные при гидролизе стандартных в-в - бензодиазепинов. После хр-графирования бензофеноны первоначально фиксируют на пластинке по собствен ному желт. окраш.. При просматривании пластинки в УФ-свете бензофеноны 1 обнаруживают характерную флуоресценцию. Затем проводят непосредственно на пластинке р-цию Браттона-Маршалла. Хр-графическую пластинку последовательно опрыскивают 0,1% р-ром нитрита натрия, 2 М р-ром хлоровод. к-ты. Ч/з 1-2 мин обрабат. 2% щелочным р-ром β-нафтола. Флуоресцирующие пятна на пластинке окрашиваются в оранжево-крас. цв. Пятна 2-метиламино-5-хлорбензофенона не переходят в красно-оранж. цвет, но при обработке хроматограммы 10% р-ром хлорной к-ты дают яркую флуоресценцию в УФ-свете при 254 и 360 нм.

УФ-спектрофотометрия исп-ся после проведения ТСХ и элюирования бензофенонов с пластинки спиртом или ацетоном. Бензофеноны имеют характерную абсорб­цию в области 230-240 и 390-410 нм.

Оценка. Описанное иссл-ние по 1 направлению имеет судебно-хим. зна­чение при получении отрицат. рез-та. При получении положит. испытаний по 1 направлению проводят дальнейший анализ.

Определение индивидуальных производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов.

Для обнаружения отдельных в-в и их мет-тов изол-ние проводят путем на­стаивания с полярным раств-лем и экстрагируют из водного р-ра хлороформом при рН=2 и рН=10 или исп-ют сорбционный метод на полимерных сорбентах с по­следующим элюированием исследуемых соед-ний с сорбента. Полученные экстракты (элюаты) упаривают до небольшого объема ~ 0,5-1 мл (концентрирование). Для обна­ружения производных 1,4-бензодиаз. и их мет-тов в полученном концентрате исп-ют хр-графию в тонком слое сорбента, УФ-спектрофотометрию, газожид­костную, ВЭЖХ и хим. метод.

Хроматография в тонком слое сорбента. Часть р-ра наносят в виде точки на стартовую линию хр-графической пластинки «Силуфол УФ-254». В кач-ве «стандартов» на пластинку наносят по 10-15 мкг р-ров хлозепида, диазепама, нитразепама и оксазепама. Пластинку помещают в одну из систем раств-лей: хлороформ -ацетон (90:10) или этилацетат - 25% рр аммиака - уксусная кта (26:1,6:3,3), позволяющих разделить бензодиазепины. Для обнаружения бензодиаз. на пластинке ее обрабатывают реактивами в опре­д. послед-ности. Пластинку опрыскивают р-ром нингидрина и затем 5 мин нагревают при 100°С. Образуются пятна желт. цвета. При последующей об­работке реактивом FNP (смесь хлорида железа (III), хлорной и азотной к-т) желтые пятна приобретают голубой цвет. Эту же пластинку опрыскивают подкисленным йодпла-тинатом - пятна приобретают темный цвет. Заключение о нахождении в извлечении конкретного производного 1,4-бензодиазе­пина по рез-там ТСХ можно сделать, если цвет и Rf исследуемого в-ва и «стан­дарта» полностью совпадают.

УФ-спектрофотометрия проводится после очистки экстрактов с помощью ТСХ, элюирования в-в с пластинки этил. спиртом, 0,1 М р-ром серной (хлоро­водородной) к-ты или смесью 1 М р-ра хлоровод. к-ты и метилового спирта (1:9). При регистрации спектра поглощения производные 1,4-бензодиаз. и их мет-ты определяют по характерным максимумам и минимумам в спектре.

Газожидкостная хр-графия. Обнаружение проводят по соответствующим индексам удержива­ния.

ИК-спектроскопия. Сухой остаток после испарения хлороформного экстракта или элюата растирают с кристаллами бромида калия и прессуют в виде диска. В ИК-спектре бензодиазепинов появл-ся интенсивные полосы за счет валентных колебаний ОН-, NH-, СО-, С-С- групп.

ВЭЖХ. В «указанных» условиях удается четко разделить м/у соб. все производные бен­зодиазепинов и бензофеноны. Для обнаружения иссл-ых в-в сопоставляют время (объем) удерживания и коэфф-ты емкости определяемых в-в и образцов сравнения - эталонных р-в бензодиазепинов и бензофенонов, а также УФ-спектры исследуемого ком-та и образца сравнения при двух и более длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.

Химический метод основан на исп-нии реакций, в рез-те к-х образ-ся окраш. продукты.

Реакция с нингидрином. К 2-3 мл р-ра остатка или элюата в этил. спирте приб. 10 мг нингидрина и 2 мин нагревают на вод. бане. Р-р окраш. в синий цвет. При добавлении 1% р-ра сульфата меди(II) окраска переходит в красную или оранжево-красную (диазепам), в желто-корич. (нитразепам), в корич. (хлозепид).

Реакция гидролиза амидокарбинольной группы. Эта р-ция исп-ся для обнару­жения оксазепама (нозепама). К сухому остатку приб. 5 мл 96% этил. спирта и 4 капли конц. фосфорной к-ты. Смесь нагревают на кипящей вод. бане не менее 5 мин. Р-р охлаждают. К 1 мл полученного р-ра доб. 5 мл воды очищ. и 1 мл фуксинсернистой (хромотроповой) к-ты - наблюдают появление фиол. окраш.. В рез-те гидролиза амидокарбинольной груп­пы образуется формальдегид, к-й с фуксинсернистой к-той (или хромотроповой к-той) дает характерное окрашивание.

Реакция с реактивами Марки и Фреде. При нанесении на сухой остаток в фарфоро­вой чашке, полученный при испарении хлороформного экстракта или элюата, реактива Марки или реактива Фреде, хлозепид образует желтое окрашивание.

Количественное определение.

Метод ВЭЖХ.

Метод добавок. Анализ проводят с экстрактом из биологического объекта или с элю-атом после проведения твердофазной экстракции с добавлением в него определенно­го количества (эталонный раствор) обнаруженного бензодиазепина или бензофенона. Концентрацию исследуемого соединения рассчитывают по формуле.

Метод внешнего стандарта. Вслед за анализом с помощью ВЭЖХ исследуемого экстракта или элюата проводят определение в тех же условиях эталонного раствора, кон­центрация которого близка к концентрации анализируемого соединения в извлечении из объекта.

Метод внутреннего стандарта. В биологический объект до начала его пробоподго-товки к анализу добавляют известное количество вещества, принятого за стандарт. После исследования с помощью ВЭЖХ расчет концентрации определяемого соединения прово­дят по формуле.

Фотоколориметрия по реакции образования азокрасителя (реакция Браттона-Маршалла). Метод основан на гидролизе бензодиазепинов до аминобензофенонов. Сухой остаток хлороформного экстракта или элюата растворяют в 5 мл 2 М раство­ра хлороводородной кислоты, добавляют 1 мл 0,1% раствора нитрита натрия, через 5 мин - 0,5 мл 1% раствора сульфамата аммония (или насыщенного раствора мочевины). Полученный раствор встряхивают до полного удаления пузырьков газа, после чего до­бавляют 1 мл 0,1% раствора N-1-нафтилэтилендиаминдихлорида. Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют через 15 минут на ФЭК-56 М в кювете с толщиной слоя 10 мм и зеленым светофильтром. Раствор сравнения - смесь реактивов.

Производные фенотиазина (аминазин, дипразин, левомепромазин, тиоридазин). Химическое строение и свойства. Токсичность. Метаболизм. Методы изолирования, обнаружения, количественного определения.

Слева направо: аминазин (хлорпромазин), дипразин (прометазин, пипольфен), левомепромазин (тизерцин), тиоридизан (сонапакс).

Токсиколог. значение. Многие производ. ф-зина проявляют специфическ. д-вие на ЦНС и психическую сферу. Силь­нейшее д-вие на псих. сферу проявл. соед-я, у к-х третичный азот в боковой цепи отделен от атома азота фенотиазинового ядра тремя метилен. группами. Меньшее число метилен. групп приводит к появлению противогистаминной акт-сти. Для производ. ф-зина выявлена спос-сть сни­жать т-ру тела, уменьшать позывы к рвоте у беременных, снимать зуд и т.д.

Наибольш. токсиколог. знач. имеет амина­зин. Описаны случаи отравления аминазином при передо­зировке, несчастных случаях с детьми, при приеме его с целью самоубийства. В больших дозах аминазин вызывает состояние, близкое к физиолог. сну. При отравлении - резкая сла­бость, головокруж., сухость во рту, тошнота, судороги, потеря сознания, учащение пульса, падение давления, кожные аллерг. р-ции. При острых отравлениях - коматозное состояние, зрачки расширены и на свет не реагируют, резко угнетается дыхат. и сосудодвиг. центры, развивается непроходимость кишечника, тахикардия, эпилептические судороги. Смерть наступает при явлениях нарастающей легочно-сердечной недост-сти.

Свойства - белые (или со слабым желтоват., сероват., кремовым оттенком) кристалл. в-ва. Они легко окисляются (даже кис-дом воздуха) и темнеют. Соли производных фенотиазина хорошо раств. в воде, этаноле, практически нераств. в диэтил. эфире. Основания предст. соб. сиропообразную массу, к-я плохо раств. в воде, но хор. - в этаноле, хлороформе, диэтил. эфире, этилацетате. Производ. ф-зина – в-ва основного хар-ра, к-й обусловлен наличием в стр-ре мол-лы гетероциклическ. атома азота и третичного атома азота в алифатическом радикале.

Объекты анализа: желудок с содержимым, мозг, почка, моча, печень с желч. пузырем, кровь, лек. пр-ты

Изолирование. При нецеленаправл. ан-зе изолируют путем настаивания с подкисленной водой (метод Васильевой) или подкисленным спиртом (метод Стаса-Отто). Производ. ф-зина обнаруживают в хлороформном экстракте, полученном из водной вытяжки при рН=8-10. При направл. ан-зе для производ. ф-зина исп-ют частный метод Е.М.Саломатина. Производ. ф-зина экстрагируются диэтил. эфиром при рН=13. При проведении общего ТСХ-скрининга производ. ф-зина м. б. обнаружены на хр-графической пластинке при ее обработке хлоридом железа (III) в виде окрашенных пятен, к-е при дальнейш. обработке реактивом Драгендорфа окраши. в оранж. цв. С осадительными реактивами производные ф-зина образуют аморфные осадки. Для обнаружения индивид. соед-ний исп-ют р-ции окрашивания, УФ-спектрофотометрию, ГЖХ, ИК-спектроскопию и ВЭЖХ.

Обнаружение. Реакции окрашивания. 1) р-ции окисления (при исп-нии хлорной к-ты, нитрита натрия, реакти­вов Фреде, Манделина, конц. серной к-ты); 2) р-ция с формальдегидом в присутствии конц. серной к-ты (ре­актив Марки); 3) окисление соед-ями, сод-щими металлы с высшей степенью окисления ((FeCl₃), платинохлороводород. к-та (H₂PtCl₆)]. Для проведения р-ций хлороформный экстракт испаряют в фарфоровых чашках и на сухие остатки наносят соотв-щие реактивы - наблюдают появление хар-ного окрашивания. Эти р-ции малоспецифичны, т. к. образ-ся смеси продуктов окисления и пер­воначальная окраска быстро переходит в красное, вишнево-крас., красно-оранж., малиновое, бурое или фиол. окраш.

Микрокристаллоскопические реакции. Аминазин, дипразин с 5% рром золотохлоро-водород. кы образуют кристаллич. осадки. С солью Рейнеке т/ж образ-ся кристаллич. осадки, но по их форме отли­чить производные фенотиазина друг от друга невозможно.

УФ-спектрофотометрия. В УФ-области спектра производные ф-ина обна­руживают два максимума светопоглощения. Для основных метаб-тов производ. ф-зина (сульфоксидов) - 4 мак­симума светопогл-ния. Анализ по УФ-спектрам поглоще­ния проводят после очистки извлечений из объектов с помощью хр-графии в тонком слое сорбента. Измерения проводят в 0,5 М р-ре серной к-ты и фиксируют хар-ные полосы поглощения.

Газожидкостная хроматография. Обнаружение производ. ф-зина проводят по параметрам удерживания (времени или объему удерживания или относительному времени удерживания). В качестве вну­треннего стандарта используют имизин.

ИК-спектроскопия. В ИК-спектрах производных ф-зина обнаруживают опре­д. характеристические частоты, отражающие типы связей и функц. группы в мол-лах. Для проведения ан-за очищенный остаток после испарения экс­тракта из био. объекта растирают с кристаллами бромида калия, прессуют и полученный диск помещают в прибор. ИК-спектр сравнивают со спектрами, имеющи­мися в специальных справочниках.