Хроматографические методы

В химико-токсиколог. исслед-ях наиб. часто применяют разл. типы хроматографическ. методов: тонкослойную хр-фию (ТСХ), высокоэффективную жидкостную хр-фию (ВЭЖХ), газовую хр-фию (ГХ).

Хроматография – разделение в-в, основанное на распределении компонентов смеси м/у неподвижной и подвиж. фазами. Мол-лы разделяемых в-в диффундируют ч/з пов-сть раздела фаз и в завис-сти от хим. природы удерживаются той или иной фазой по-разному. В завис-сти от агрегат. состояния подвиж. фазы различают жидкостную и газовую хроматографию.

В основе газовой хр-фии лежат процессы распределения и адсорбции. В ТЖХ и ЖЖХ процесс разделения в значит. степени опред-ся составом подвиж. фазы. ГЖХ прим. глав. образ. для аналитическ. целей, а жидкостную хр-фию чаще для препаративных целей.

1) Тонкослойная и бумажная хр-фия. Методы основаны на различии скоростей перемещения компонентом анализируемой смеси в плоском тонком слое сорбента при движении растворителя (элюента). Раств-тель перемещается под д-вием капиллярных или гравитационных сил. В ТСХ слой сорбента наносят на поддерживающую подложку (пластинку, пленку). В БХ роль рабочего слоя играет лист специальн. бумаги для хр-фии. Преимущество ТСХ – при небольш. затратах можно быстро и эфф-тивно разделять различ. смеси. Пластинки для хр-фии произв-ся промыш. способом. Разделение в ТСХ осущ-ся вследствие многократ. пересечения мол-лами в-в границы фаз твердая-жидкая или жидка-тверд., т.е. вследствие многократ. распределения в-ва м/у подвиж. и неподвиж. фазами. Неподвиж. фазой служит либо сухой сорбент (адсорбционная хр-фия), либо сорбент, покрытый жидкой фазой (распределительная хр-фия). Систему раств-лей подбирают в соотв-вии со св-вами разделяемых в-в. Поляр. в-ва следует разделять в поляр. раств-лях; малополяр. – в менее полярных или неполяр. раств-лях. Количетсвенно подвижность выражается вел-ной R_f – фактором удерживания, равным отношению расстояний от стартовой точки до середины пятна в-ва (l) и от стартовой точки до линии фронат раств-ля (L). Больш-во хим. соед. бесцветно, и для их обнаружения на пластинке исп-ют различ. физ. и хим. методы (флуоресценция). Сорбенты закрепляют при помощи неорг. или орг. связующих материалов. Сорбенты: силикагель (неполяр. в-ва; в-ва с основными св-вами); оксид алюминия (пов-сть сорбента сильнополярная, прим. для слабополярных основных в-в); модифицированный силикагель (поляр. в-ва); полиамид.

ТСХ в химико-токсиколог. анализе. Токсиканты орг. природы и их метаболиты экстрагируются орг. раств-лем из образца с различ. значениями рН. Экстракты анализируют методом ТСХ на одной пластинке с одним и тем же раств-лем. Жиры, сод-щиеся в экстрактах содержимого желудка, затрудняют хроматограф. анализ. Необходима очистка образца методом повторной экстракции в водную фазу при различ. значениях рН. Достовреность идентификации возрастает при исп-нии реактивов, с к-ми определяемое в-во дает окрашен. продукты.

2) Колоночная хр-фия. Неподвиж. фазу помещают в колонку, затем вносят в нее анализируемую смесь и элюируют подходящим раств-лем. При продвижении по колонке комп-ты смеси удерживаются сорбентов в соотв-вии с ф.-х. св-вами и поэт. мигрируют с разной скоростью. На выходе из колонки разделяемые в-ва появл-ся в опред. последов-сти и м.б. собраны в виде отдельных фракций.

2.1) ВЭЖХ – метод разделения в-в на мелкозернистых сорбентах (с частицами размером менее 15 мкм) при повышенном давлении. Из-за высок. рабочего давления (десятки атмосфер) приборы для ВЭЖХ отлич-ся от приборов для классическ. колоночной хр-фии. Растворители для ВЭЖХ должны соотв-вать стандарту «особо чистые раств-ли», иметь миним. вязкость, обеспечивать макс. селективность разделения; не должны сод-жать взвешенных частиц и комплексообраз-щих ионов, способствующих коррозии металлическ. частей насоса. Хроматографы для ВЭЖХ сост. из насоса, обесп-щего рабочее давление до 200*10⁵ Па; манометра; капилляров из нержав. стали; устройств для ввода пробы (автосемплер); колонок и высокочувствит-го детектора (выявляют в-ва в потоке элюента по хар-ным св-вам – цвету, флуорес. и др.). Для ВЭЖХ выпускают специальн. сорбенты.

2.2) Газовая хроматография – метод разделения летучих в-в: газов (при норм. т-ре) или паров (при повыш. т-ре). В кач-ве неподвиж. фазы в ГХ применяют тверд. материалы (насадочные или набивные колонки), тверд. материалы, покрытые слоем ж-сти (капиллярные колонки). В завис-сти от состояния фаз различают газотвердофазную или распределит. хр-фию. В кач-ве подвиж. фазы исп-ют газ-носитель, переносящий разделяемые в-ва ч/з колонку. Разделение анализ-мой смеси происх. за счет различ. времени удерживания в-в в неподвиж. фазе. Газ и парообраз. в-ва в кач-ве подвиж. фазы им. ряд преимущ. по срав. с ж-стью: относительно малая вязкость газов и паров позволяет исп-вать колонки больше длины, что дает оч. высок. эфф-сть разделения; сильное различие св-ств газов или паров (элюентов) и разделяемых соед-ний породило разнообр. методы детекции в-в, выходящих из колонки (высок. чувств-сть). ГХ дает возм-сть разделять смеси исключит-но близких по св-вам в-в. В кач-ве элюента для газовых хроматографоф исп-ют сжатый газ из баллонов или генераторов гахов (водорода, азота). Для качественного пред-ния в-в без стандартов пользуются индексами удерживания Ковача, к-е по сущ-ву явл-ся относит-ми параметрами удерживания. Стандартами в этом случае служат алканы, введенные в колонку, а искомые в-ва «привязывают» к ним по относит-ным временам удерживания. При количеств. оценке рез-тов больш. знач. имеет форма пика. Детекторы: д-р по теплопроводности (катарометр); д-р электронного захвата, плазменно-ионизационный д-р.

СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.

Методы спектрометрии основаны на поглощении электромагнит. излучения определяемым в-вом. Область спектра хар-ся опред-ным участком длин волн электромаг. излучения. Для обнар. яд. в-в в токс. химии исп-ся спектрометрию в ближней ультрафиолетовой области от 200 до 380 нм, в видимой области и средней инфракрасной области спектра. УФ область требует специальн. (вакуумных) устройств. Инфарк. в нашей стране не прим-ся.

1) Спектрофотометрия в УФ-области спектра. Спектрофотометрия – метод анализа, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромаг. излучения, обусловленного электронными переходами: (перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления). Различ. переходы в мол-лах в-в требуют неодинак. энергии, а поэтому полосы поглощения располаг-ся при разных длинах волн. Наибольшей энергии требует переход (н-р, такой переход у пахикарпина, кониина). характерен для орг. соед., сод-щих n-электроны. характерны для гетероцикл. соед. с сопряженными связями (соед. с бензольным кольцом – атропин, промедол, эфедрин). Исп-ние УФ-спектроф-мии в химико-токс. ан-зе осложняется присутствием в извлечении примесей эндогенных соед-ний (особ. когда гнилост. разложение). Энд. соед. создают «фоновое поглощение», искажают хар-тер спектра. Для устранения фон. поглощ. исп. очистку.

2) Масс-спектрометрия. Осн. отличие масс-спектр. от др. ф-х. методов сост. в том, что оптические рентгеновские анализаторы детектируют излучение или поглощ. энергии мол-лами или атомами, а масс-спектрометрия определяет сами частицы в-ва (мол-лы, атомы) и основана на разделении атомов различ. эл-тов по отношению массы к заряду. Т.к. атомы различ. эл-тов имеют неодинак. массу, их можно отличить др. от др. В процессе ан-за измер-ся отношение массы частицы к заряду, для чего исп-ся законы движения заряженных частиц материи в магнитном и электрич. полях. Т.е. для проведения масс-спектрометрии необходимо прежде всего перевести нейтральные мол-лы и атомы, составляющие любое орг. или неорг. в-во, в заряженные частицы – ионы. Этот процесс наз-ся ионизацией и по разному осущ-ся для орг. и неорг. в-в. В целом масс-спектрометрию можно рассматривать как совок-сть ионизации, разделения ионов по массам и регистрации образующихся ионов. Ионизация. Для орг. соед. прим-ся электронный удар (бомбардировка пучком электронов). При этом из нейтр. частиц выбиваются электроны и образ-ся положит. ионы. У иона м.б. небольш. время жизни и поэт. происходит фрагментация – распад, и он не достигает регистрирующ. устройства. Во избежании этого процесса исп-ют хим. ионизацию. Масс-анализаторы. Образовавшийся в источнике любого вида пучок ионов поступает в масс-анализатор, где происх. разделение составляющих ионного пуска по массе. Детектор. После происходит регистрация частиц в-ва на детекторе. Это м.б. фотопластинка с чувствительной эмульсией (масс-спектрограф). В наст. вр. исп-ют электронные умножители (масс-спектрометр).

Сочетание масс-спектрометрии с другими методами. Для расщифровки масс-спектров сложных многокомп. смесей исп-ют гибридные методы. 1) Сочетание газовой хр-фии с масс-спектрометрие дает метода ГХ/МС, с пом. к-го сложную трехсоткомпонентную смесь можно разделить и идентиф-вать, если даже сод-ние комп-тов в пробе сост. около 10^-12 г. При хр-фии происх. предварит. разделение исход. сложной смеси на относительно простые фракции. Некот. орг. соед-я невозможно разделить с пом. ГХ, но можно с пом. жидкостной хр-фии (ЖХ/МС). В рез-те таких сочетаний полученные спекрты дают инф-цию о качеств. и колич. составе пробы. 2) Тандемная масс-спектрометрия (МС/МС), когда масс-анализаторы выстраиваются друг за другом. При ан-зе слож. орг. мол-лы ее разрывают на фрагменты и выделяют в первом масс-анализаторе те, к-е представляют интерес. Во втором – эти фрагменты разбивают на более мелки и сортируют по массам.

Факторы, искажающие измерение в масс-спектрометрии – атмосферный фон, поверхностные загрязнения, матричный эффект и др. Поэт особ. требования к чистоте хим. посуды, реактивов, лаб. помещ. Д.б. оч. точная мерная посуда.

ИММУНОХИМИЧЕСК. МЕТОДЫ АНАЛИЗА.

Основаны на специфическом связывании определяемого соед-я соответств-щими антителами. Они высокочув-ны, имеют групповую специфичность, просты в исполнении, позвол. одновр. исслед-вать больш. число проб без специальн. подготовки. Иммунохим. р-ция в р-ре м/у антителами (АТ) и антигенами (АГ) протекает в неск-ко стадий. На 1вом этапе происх. образ-е комплекса АГ-АТ. Этот комплекс можно идентиф-вать, если в один из исходных комп-тов ввести метку, к-я легко детектируется соотв-щим высокочувств-ным ф-х методом (радионуклидные, ферментные, флуоресцентные). Классическ. методики иммунохим. ан-за основаны на образ-нии осадка в присутвии антигена (иммунный комплекс). За этим процессом обыно наблюдают визуально и обнаруживают или полуколичественно определяют относительно высокие конц-ции комп-тов. Такой вариант длителен и трудоемок. Такой метод можно исп-вать как качественный. Наибольш. развитие получил радиоиммунный анализ (РИА). Возможность определять метку радионуклида ¹²⁵I в оч. малых конц-циях значит-но повысило чувств-сть ан-за. Недостатки: органич. срок жизни радиоакт. метки, что требует постоянной замены реактивов; относит. дорогое специальн. оброуд-ние для регистрации радиоактивности; возможность радиоакт. загряз. окр. среды; необ-сть соблюдения специальн. мер предостор-сти и высок квалиф-ции обслуж-щего персонала. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) – для идентиф-ции и локализации антигенов в гистохим. препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах. В ИФА исп-ся высокочувств. метка – молекулы ферментов. Исп-ют различ. оксидазы, учавств-щие в ок-нии субтсрата с образ-ем окраш. продуктов. По интенс-сти окраски судят, н-р, о присутствии и кол-ве нарк. в-ва в анализ. пробе. ИФА бывает: 1) Гомогенный – основан на различиях св-в ферментной метки в свободном виде и в иммунохим. комплексе. В гомог. ИФА все комп-ты р-ции – антитела (антисыворотки), определяемое в-во, меченное определяемое в-во (конъюгат), хромогенный субстрат образуют гомогенную фазу и находятся в р-ре. На 1вой стадии в реакционной среде присутствуют одноврем-но аликвота анализ-мой пробы, конъюгат и антитело. Вследствие обратимости р-ции связывани антитело-антиген опред-мое в-во биопробы (гаптен) и конъ.гат (меченый гаптен) конкурируют м/у собой за огранич. число центров связывания антитела. На 2й стадии к реакц. смеси доб-ся хромогенный собстрат, к-й под д-вием фермента-метки претерпевает хим. превращение с образ-ем окраш. продукта. Окраска регистр-ся визуально или спектрофотометрически. Интенсивность окраски анал-го р-ра после добавления субстрата прямо пропорц-на конц-ции не связанного с антителом меченого гаптена, т.е. пропорц-на сод-нию ксенобиотиков в пробе. 2) Гетерогенный (твердофазный) ИФА – антитело иммобилизируется на тверд. носителе – на полистирольных планшетах, пробирках, бусах. Кроме того, предусматр-ся стадия разделения реагирующих комп-тов, наз-мая отмывкой. Добавленный после отмывки хромогенный субстрат каталитически превращ-ся в окраш. соед-ние. В кач-ве метки часто исп-ют пероксидазу, β-галактозидазу, алколин-фосфатазу. Гетерог. ИФА высокочувст-лен, но более длителен по срав. с гомог. ИФА.