Количественное определение

Метод газовой хроматографии. Определение проводят по площади или высоте пика анализируемого вещества и внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют аналог исследуемого вещества, меченного стабильным изотопом, в частно­сти, дейтерированные соединения. Хроматографический внутренний стандарт добавляют в анализируемую пробу непосредственно перед вводом в хроматограф в концентрации, сопоставимой с концентрацией анализируемого вещества. Чтобы контролировать весь процесс пробоподготовки и анализа, внутренний стандарт часто рекомендуют добавлять к аликвоте биожидкости, отобранной для гидролиза или изолирования. В этом случае внутренний стандарт подвергается всем операциям вместе с анализируемым веществом. В таком варианте использования внутреннего стандарта результаты количественного определения будут более точными и воспроизводимыми.

Содержание каннабиноидов рассчитывают по калибровочному графику, выражаю­щему зависимость высоты (площади) пика ионов анализируемого вещества (внутреннего стандарта) от концентрации в диапазоне 1,0-10,0 мкг/мл.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Определение концентрации каннабиноидов проводят, используя метод добавок, метод внутреннего или внешнего стандарта.

Эфедрин и продукт его окисления - эфедрон. Фенилалкиламины (амфетамин, метамфетамин). Строение и свойства. Токсичность. Метаболизм. Методы изолирования, обнаружения, количественного определения.

Слева-направо: эфедрин, эфедрон, амфетамин, метиламфетамин (метамфетамин, первитин).

Наибольшее мед. применение имеет эфедрин. Он исп-ся в кач-ве сосудосуж. и бронхорасшир. ср-ва. Амфетамин явл-ся психостимулятором. Его применение возможно при астениче­ских явлениях после черепно-мозг. травм, после длит. постельного режима.

Применение производ. фенилалкиламинов, особенно амфетамина и близких ему по хим. строению соед-й, ограничено. Это связано с тем, что побоч. эффектом их д-вия явл-ся эйфорическ. сост-е, т.е. эти производные имеют высокий наркоманический потенциал. АМФЕТАМИН прим-ся оч. редко, что связано с побоч. влияниями (нарушение высш. нервн. деят-сти, повы­шение АД, аритмии, сонливость, апатия вместо возбуждения, потеря работоспособности, формирование завис-сти, увеличение вероятности мозговых кро­воизлияний, параноидные психозы). МЕТАМФЕТАМИН в РФ перенесен в сп.к № 1 (запрещен). Злоупотребление амфетаминами часто сочетается со злоупотр. спирт. напитками и снотв. ср-вами, что приводит к более грубым личностным измене­ниям, и по клинической картине они близки к кокаинизму. Амфетамины вначале вызывают прилив сил, эйфорию, потерю аппетита, учащение пуль­са и дыхания, расш. зрачков. Длит. прием амфетаминов приводит к быстро­му снижению веса, иммунитета, разрушению легких, печени, почек, ухудшению зрения, головокруж., потере координации и коллапсу. Психическ. зависимость развивается оч. быстро - после 3-5 внутривенных инъекций и ч/з 2-3 нед. нерегуляр. ораль­ного приема. Физ. завис-сть хар-ся признаками синдрома отмены. Абстинентный синдром возникает ч/з 9 ч после отмены пр/та и может длиться до 10 нед. Прием больших доз («сверхдоза») сопров-ся увелич. кровяного давл., появлением лихорадоч. состояния, токсическими («амфетаминовыми») психозами, подобными параноидной шизофрении, серд. приступами и инфарктом. Картина острого отравления амфетамином похожа на острое смертельное отравление кофеином и дополняется нарушением серд. проводимости. ЭФЕДРИН - алкалоид, сод-щийся в различ. видах эфедры. Он прим. в мед. практике в виде гидрохлорида. Его назна­чают для стимулирования α- и β-адренорецепторов, ЦНС, для сужения сосудов и умень­шения воспалит. процессов при ринитах, для повышения АД, при оперативных вмеш-вах, при травмах, кровопотерях, при миастении, нарко­лепсии (непреодолимого желания спать), отравлении снотв. и нарк. ср-вами, местно - как сосудосуж. ср-во, при бронхоспазмах и для рас­шир. зрачка с диагностической целью. К эфедрину м. б. привыкание. В судебно-мед. практике отравления эфедрином встречаются при исп-нии его в кач-ве гипертензивного пр-та для искусственного повышения АД. Клиника острого отравления хар-ся вначале бессонницей, головокруж., тремором конечностей, сердцебиением, повышением АД, аритмией, затем возникают тошнота, рвота, задержка моче­испускания, возбуждение ЦНС, резкое психическое и двигательное беспокойство, отек легких, повышенная возбудимость дыхат. центра и его истощение. ЭФЕДРОН (марчефаль, джеф) -продукт окисления эфедрина. Злоупотребление этим в-ом носит название «эфе-дроновой наркомании». Список №1 ПККН. С повышением толерантности число инъекций может доходить до 10 раз в сутки и более. Нарк. эффект развивается сразу или ч/з 15-20 мин и длится 6-8 ч. Состояние опьянения хар-ся чувством эйфории, прилива энергии, легкости тела, ясности мысли, повышенной трудосп-сти. Больные многословны, суетливы, деят-сть их непродуктивна, свое состояние они оценивают как «состояние счастья, безмерной радости». При введении наркотика наблюдаются вегетативно-сосуд. из­менения: возникает ощущение ползанья мурашек, развивается тахикардия, сухость во рту, повышается АД. У больных наблюдаются тяжелые неврологические и психич. расстройства. Психозы хар-ся бредом преследования, ревности, тревогой, страхом, больные боятся людных мест, не могут переходить улицу, пользоваться метро и т.д. Одновременно они ищут общения и отличаются многословием, непоследовательностью, суетливостью, неусидчивостью. Метиленоксипроизводные амфетамина (экстази). Популярным наркотиком является метилендиокси-метамфетамин - МДМА («экстази»).

Последствия - психозы, депрессии, необратимое разрушение личности, отмечены многочисленные случаи тяжелых психических забо­леваний. Смерть наступает в рез-те осложнений сердечно-сос. системы, острой сердечной не­дост-сти, остановки сердца, отказа почек, гипертермии.

Метаболизм. Быстро всас-ся из ЖКТ после орального прим-я. Они легко преодолевают гематоэнцефалический барьер. В метаболизме можно выделить следующие осн. про­цессы. В I фазе метаб-ма проходит окислительное дезаминирование, гидроксилиро­вание ароматического кольца, деалкилирование у азота боковой цепи. Во II фазе метабо­лизма гидроксилированные метаболиты образуют конъюгаты с глюкурон. и серной к-тами.В неизмененном виде амфетамин и эфедрон выводятся с мочой в кол-ве 20-30%, метамфетамин - около 45%, эфедрин - 55-75%, норэфедрин - 90%.

Физико-хим. св-ва. В виде солей хлороводородной к-ты это белые крист. в-ва без запаха, легкораств. в воде, эта­ноле, практически нераств. в диэтил. эфире и хлороформе. Все производные фенилалкиламинов - вещества основного хар-ра. Основания этих в-в, за искл. эфедрина, предст. соб. масляни­стые, труднолетучие ж-сти. Они хор. раств. в этаноле, хлороформе, диэти­л. эфире. Основание эфедрина хорошо раств. в воде.

Изолирование. При изол-нииобщими методами (ненаправл. анализ) производные фенилалкиламинов экстрагируются хлороформом в виде оснований из водных вытяжек при рН=8-10. При направл. ан-зе - экстрагируют из водных вытяжек при рН=12 диэтил. эфиром или хлорофор­мом. Рек-дуется для изол-ния из мочи исп-вать твердофазную экстракцию. Для очистки извлечений предложена реэкстрация при разных значениях рН.

Обнаружение.

Хр-графия в тонком слое сорбента. Остаток после испарения экстракта из во­дной вытяжки при рН=11-12 наносят на пластинки «Сорбфил». Параллельно на старто­вую линию наносят спирт. р-ры «стандартов» эфедрина, эфедрона, метамфетамина. Пластинки помещают в системы раств-лей бензол - этанол -диэтиламин (9:1:1), хлороформ - ацетон - этанол - 25% р-р аммиака (20:20:3:1) или толуол - этанол - триэтиламин (9:1:1). После пробега фронта раств-ля на рас­ст. 10 см пластинку вынимают, высушивают и фенилалкиламины обнаруживают путем обработки пластинки реактивом Драгендорфа – появл. оранж. пятна. При опрыскивании пластинки р-ром нингидрина в ацетоне (или н-бутаноле) и при нагревании в сушильном шкафу при 70-80°С эфедрин и эфедрон образуют пятна на пла­стинке, окрашенные в синий или сине-фиолет. цвет, амфетамин - пятна голубого цвета, метамфетамин - желто-корич.

УФ-спектрофотометрия исп-ся после очистки извлечений (экстрактов) из объектов с помощью хр-графии в тонком слое сорбента и элюировании с пла­стинки очищенных соед-й 0,1 М р-ром хлоровод. к-ты. Эфедрин, амфетамин и метамфетамин в среде хлоровод. к-ты имеют три полосы поглощения с максимумами при 251, 257 и 263 нм. В УФ-спектре раствора эфедрона обна­руживается одна полоса с максимумом при длине волны 251 нм.

ИК-спектроскопия. Остаток после испарения хлороформного экстракта очищают с помощью тонкослойной хр-графии, с пластинки фенилалкиламины элюируют эта­нолом, к-й испаряют досуха. Сухой остаток растирают с бромидом калия, прессуют и анализируют в ИК-спектрометре.

ВЭЖХ. Условия: прибор «Милихром», колонка 62*2 мм, сорбент обращенно-фазовый «Сепарон С-18» (5 мкм), подвижная фаза (элюент) - смесь водного 0,2 М р-ра ортофосфорной к-ты, мета­нола и диэтиламина 75:20:1. Обнаружение производных фенилалкиламинов проводят по времени (объему) удер­живания.

Газохроматографический анализ в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС). Проводится после получения фторпроизводных с испо-ем детектора по захвату электронов. Сухой остаток после испарения экстракта из водной вытяжки с рН= 11-12 раство­ряют в 0,5-1 мл толуола и доб. соотв-щий реактив для перевода фенилал­киламинов в летучее фторпроизводное.Смесь нагревают до 60°С 30 мин. После охлаждения доб. 5% р-ор гидрокар­боната натрия и верхнюю фазу, сод-щую фторпроизводные, вводят в газовый хрома­тограф, соединенный с масс-спектрометром. Обнаружение проводят по времени удерживания и характерным линиям, выражающим отношение m/z в масс-спектре.

Химический метод.

Р-ции окрашивания. Проводятся на фарфор. чашках с сухими остатками, по­лученными после испарения экстрактов из био. объектов. Р-кция с реактивом Марки. На сухой остаток наносят реактив Марки. При наличии амфетамина наблюдают оранж. окраш., переходящее постепенно в корич.. При наличии метамфетамина образуется желто-зел. окрашивание. Р-ция с нингидрином. При добавлении к сухому остатку гидроксида натрия до рН=8,5, р-ра нингидрина и последующем нагревании эфедрин образует сине-фиолет. окраш., эфедрон - фиолетовое, амфетамин - розово-оранжевое, ме­тамфетамин - зеленое.

Микрокристаллоскопические реакции. Из производных фенилалкиламинов кристал­лические осадки образует с различ. реактивами только эфедрин. На сухой остаток наносят каплю 0,1 М р-ра хлоровод. к-ты и каплю соотв-щего ре­актива. Ч/з 10-15 мин наблюдают кристаллы характерной формы при рассматривании под микроскопом.

Р-ция с реактивом Драгендорфа в модификации А. С. Тищенко. Состав исполь­зуемого реактива: 1,5 г висмутата натрия (NaBi0₃), 7,5 г йодида калия (KI) растворяют в 100 мл 2% р-ра серной к-ты. Эфедрин с данным реактивом образует игольча­тые кристаллы и кристаллы в виде пластинок неправильной формы и сростки из них.

Р-ция с платинохлороводородной к-й и йодидом калия (А. С. Тищенко). К ка­пле исследуемого р-ра на предметном стекле доб.т каплю 0,5% р-ра пла­тинохлоровод. к-ты (H₂PtCl₆) и неск-ко кристаллов йодида калия. Ч/з 15-20 мин. наблюдают образование красно-фиолет. кристаллов в виде пластинок неправильной формы, собранных в сростки, напоминающие по форме ветки и розетки.

Количественное определение.

Экстракционно-фотометрический метод используется для определения эфедрина в моче. 5 мл мочи подщелачивают 0,5% раствором гидроксида натрия до рН=12 и экс­трагируют 3 раза 20 мл диэтилового эфира. Эфирные экстракты объединяют и испаряют досуха. Остаток переносят в колориметрическую пробирку, добавляют до насыщения кристаллический сульфат натрия и смешивают с 1 мл аммиачного раствора сульфата меди и 3 мл 5% раствора сероуглерода в бензоле.

Слой бензола окрашивается в желтый цвет. Оптическую плотность измеряют с помо­щью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра при длине волны 440 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчет количества эфедрина в моче проводят по калибровочному графику.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Условия определения описаны в разделе «Обнаружение фенилалкиламинов». Для количественного анализа применяют метод добавок. С этой целью проводят анализ экстракта из биологического ооъекта с до­бавлением в него известного количества обнаруженного фенилалкиламина. Расчет ведут по формуле.

Метод внешнего стандарта. Вначале проводят анализ экстракта из биологического объекта, а затем анализ эталонного раствора обнаруженного вещества с концентрацией, близкой к концентрации исследуемого соединения в экстракте. Расчет ведут по формуле.

Метод внутреннего стандарта. К объекту добавляют известное количество веще­ства, принятого за «стандарт». Концентрацию фенилалкиламина рассчитывают по фор­муле.

Особенности изолирования ряда лекарственных и наркотических веществ, находящихся в объектах исследования в виде метаболитов (на примере производных 1.4-бензодиазепина) или глюкуронидов (на примере морфина). Кислотный гидролиз объектов. Оптимальные условия проведения гидролиза и изолирования анализируемых веществ.

Производ. 1,4-бензодиазепина: хлордиазепоксид (хлозепид), диазепам (сибазон), оксазепам (нозепам), нитразепам.

При ненаправленном анализе на производные 1,4-бензодиазепина исследование проводится после изол-ния из био. материала подкисленным спиртом или покдисл. водой с хлороформным экстрактом из водной фазы с рН=2 и рН=10.

При исследовании извлечений из био. объектов исп-ют 2 направления в анализе.

1 направление основано на гидролизе бензодиазепинов до 2-аминобензофенонов. Данный способ позволяет обнаружить и определить в извлечении нативные соед-ния и их метаболиты. Этому направлению придают судебно-хим. значение при от­риц. рез-те.

2 направление исп-ся, если в процессе иссл-ния обнаружены бензофеноны по 1 направлению анализа. Этот способ позволяет точно установить природу 1,4-бен-зодиазепина по нативным соед-ям и их метаболитам.