Методы изолирования, основанные на экстракции.

I. Изолирование лек. и нарк. в-в амфильными растворителями (метанол, этанол, ацетонитрил, ацетон). Они имеют сродство к гидрофильным и гидрофоб. участкам мембран клеток, а поэт. способны лег­ко проникать внутрь клеток и извлекать лек. и нарк. в-ва. Известно, что в ионизированной форме (при рН=2) лек. и нарк. в-ва извлекаются полярными раств-лями - водой и спиртом, в молекулярной (неионизир.) форме - липофильными (неполяр.) раств-лями. С пом. амфифильных раств-лей лек. и нарк. в-ва способны извлекаться как в ионизир., так и в неионизир. форме. При изолировании не обязательно подкислять или подщелачивать объект.

1) Изолирование подкисленным спиртом.

Метод Стаса-Отто. 1-й этап. Навеску объекта массой 100 г настаивают три раза по 24 ч с 96% этил. спиртом, подкисленным щавелевой к-той до рН=2,5-3,0. Спиртовые вытяжки упа­ривают при 40°С и в полученном остатке многократно осаждают белки 96% спиртом. Очищенный остаток растворяют в 20-25 мл воды .2-й этап. Водный р-р последовательно экстрагируют хлороформом при рН=2 ирН=8-10 после подщелачивания 25% р-ром аммиака. В экстракт при рН=2 перехо­дят в-ва кислотного и слабооснов. хар-ра. В экстракт при рН=8-10 переходят в-ва основного хар-ра.Достоинство метода - он позволяет извлекать в-ва различ. при­роды. Кроме того, этил. спирт вызывает осаждение белков, что очень важно при работе с трупным материалом.Недостатки - длительность выполнения и возможные потери ис­комых в-в за счет адсорбции их белками при осаждении и фильтровании. Однако несмотря на это и на появление новых методов изол-ния, метод не теря­ет значения, особенно при иссл-нии объектов, подвергшихся сильным гнилостным изменениям.

2) Изолирование нейтральным ацетоном.

Метод В.А. Карташова. В качестве экстрагентаим предложен амфифильный раств-тель ацетон, к-й способен смешиваться как с водой, так и с липидами. 1-й этап. 5 г гомогенизированного био. материала четырехкратно извлекают аце­тоном последовательно 10,0; 5,0; 5,0 и 5,0 мл с помощью аппарата для встряхивания, каж­дый раз в теч. 5 мин. Затем пробы центрифугируют при 2,5 тыс. об./мин в теч. 5 мин. Ацетоноводный экстракт смешивают с 4 г высушенного карбоната калия. Ацетоновый слой отделяют, добавляют 20 мл 0,5 М р-ра хлоровод. к-ты и 10 мл н-гексана, встряхивают. Орг. фазу, сод-щую гидрофобные примеси, отбрасывают. 2-й этап. Водную фазу экстрагируют эфиром, эфир испаряют и анализируют на в-ва кислотного хар-ра. Оставшийся водный р-р подщелачивают 25% р-ром аммиака до рН=9-10, доб. 3 г хлорида натрия (для высаливающего эффекта) и экстрагируют ди­этил. эфиром. Эфир испаряют и остаток исследуют на в-ва основного хар-ра. Способ позволяет получать достаточно чистые экстракты. В процессе гомогенной экстракции анализируемые в-ва практически не теряются. При реэк­стракции потери в-в не превышают 5-6%.

II. Изолирование подкисленной водой. Этот метод явл-ся одним из наиб. эфф-ных и доступных. Соли мног лек. и нарк. в-в лучше раств-ся в подкисл. воде, чем в под­. спирте.

Метод А.А.Васильевой 1-й этап. Навеску измельченного био. объекта массой 100 г заливают водой очищ. (1:2), подкисляют щавелевой к-той до рН=2-2,5 и настаивают 2 раза: 2 ч и 1 ч при периодическом взбалтывании. Водную вытяжку процеживают ч/з двойной слой марли и центрифугируют. Надосадочную прозрачную ж-сть отделяют. 2-й этап. Центрифугат экстрагируют последовательно хлороформом при значениях рН=2, затем при рН=10 после подщелачивания 25% р-ром аммиака. Метод уменьшает время на вы­полнение анализа по сравнению с методом Стаса-Отто в 3-4 раза и позволяют изол-вать меньшие кол-ва ряда алкалоидов. Они не требуют затраты этил. спирта, но не пригодны при анализе сильно загнивших объектов.

Метод В.Ф. Крамаренко. 1-й этап. Навеску измельч. объекта массой 100 г заливают 0,02 М р-ром серн. к-ты (рН=2,5) и настаивают 2 раза: 2 ч и 1 ч. Водные вытяжки центриф-ют, от­деляют от осадка, насыщают сульфатом аммония и вновь центриф-ют. Центрифугат (рН=2,5) экстрагируют диэтил. эфиром с целью очистки. 2-й этап. Водную фазу после подщелачивания до рН=8,5-9 р-ром гидроксида натрия экстрагируют 4 раза хлороформом. В методе максимально учтены хим. св-ва алкалоидов и орг. оснований. Поэт. условия изол-ния и последующей экстракции опти­мальны для опред-я алкалоидов.

Метод В.И.Поповой 1-й этап. Измельч. объект массой 100 г заливают 80 мл 0,02 М р-ра серн. к-ты (рН=2-3) и настаивают 3 раза: 2 ч, 1 ч и 1 ч. Водн. вытяжку процеживают ч/з тройной слой марли и центриф-ют в теч. 25-30 мин при скорости 3000 об./ мин. Надосадочную ж-сть отделяют и очищают с пом. гель-хроматографии. С этой целью предложен гель сефадекс G-25. Барбитураты с колонки элюируют с пом. 0,02 М р-ра серн. к-ты. 2-й этап. Элюат подвергают концентрационному экстраг-нию путем повторной экстракции хлороформом или диэтил. эфиром.Метод обеспечивает хор. очистку извлечений. Он применим при иссл-нии объектов, подвергшихся гнилост. изм-ям, однако может исп-ся для изол-ния огранич. числа в-в, в частности барбитуратов.

III. Изолирование подщелоченной водой. Метод м. б. пригоден при иссл-­нии объекта на наличие некот. в-в кислотного хар-ра (салиц. и бен­зойная к-та, фенолы, нитрофенолы).

Метод П.Валова 1-й этап. Измельч. объект массой 100 г заливают 180 мл подщелоченной воды (рН=10) и настаивают в теч. 30 мин. Щелочную вытяжку центриф-ют. Надосадочную ж-сть (центрифугат) подкисляют серн. к-той до рН=2. В полученном р-ре с пом. вольфрамата натрия при нагревании осаждают белки и смесь вновь центри­фугируют. 2-й этап. Барбитураты из центрифугата экстрагируют диэтил. эфиром при значе­нии рН=2. Эфирный слой отделяют и проводят реэкстракцию водным р-ром NaOH. Щелочной водный экстракт подкисляют серн. к-той до рН=2 и бар­б-ты извлекают равным объемом диэтил. эфира. Такая повторная экстракция позволяет получить чистые извлечения. Метод эффективен, позволяет выделить 50-90% барб-тов и полу­чить достаточно чистые извлечения. Недостаток - сорбция некот. барбитуратов белками.

IV. Изолирование нарк. и одурман. в-в из мочи твердофазной экстаркцией. Он основан на сорбции ток­сических в-в на синтетических смолах, модифицированных силикагелях, активи­рованном угле и др. Авторами метода являются Т.И.Бурыкина и Б.Н.Изотов. В кач-ве сорбента ими предложен полисорб-1 (сополимер стирола и дивинилбензола). Метод разработан для выделения, очистки и концентрирования наркот. и одурман.в-в из мочи. Яд. в-ва сорбируются на полисорбе, а затем элюируются соотв-щим элюентом.

V. Экстракция орг. растворителями: исп-ют для изол-ния орг. ядохимикатов (пестициды). Чаще всего рек-дуются ин­дивидуальные методы изол-ния пестицида для кажд. объекта (воздух, пищевые продукты растит. происх., почва, кровь, моча, внутр. органы, масла и др.).

VI. Экстракция с водой в сочетании с диализом. С помощью этого метода изолируют: минеральные кислоты ( серная, азотная, хлороводородная); щелочи ( гидроксиды натрия, калия, аммиак и др.); ядовитые соли ( нитраты, нитриты). Такие иссл-ния проводят в том случае, если предварит.испытания дают для этого основание или материалы дела указывают на возможность отравления указан­ными в-вами. Для изол-ния объекты измельчают и добавляют очищ. воду до получения кашицеобразной массы, к-ю оставляют на 1-2 ч, а затем фильтруют. Для очистки полученных вытяжек применяют метод диализа. Диализ - освобождение водных вытяжек, содержащих яд. в-ва, от высокомолек. соединений при помощи полупроницаемой мембраны.

МЕТОДЫ МИНЕРАЛИЗАЦИИ.

Необходимость полной минерализации объекта связана с тем, что соли металлов в орг-зме вступают во взаим-вие с белками и образуют иногда очень прочные соед-я. В этом случае металлы почти не извлекаются из объектов обычными методами (настаиванием с различ. извле­кающими ж-стями) и не м. б. обнаружены с пом. известных р-ций. Мин-ция создает возможность получения соединений металлов, легко переводи­мых в ионное состояние. Известны 2 метода мин-ции: «мокрая мин-ция» и «сухое озоление».

I. Методы мокрой минерализации. Все методы мокрой мин-ции сводятся к разрушению орг. в-в с по­м. окислителей в кислой среде. Ок-лями при м.б. серная к-та и ее смеси с азотной, хлорной к-тами или конц. р-ром пероксида водорода. Следует подчеркнуть, что все реактивы, применяе­мые для мокрого озоления, особо опасны.Они могут вызвать сильные ожоги, являться взрывоопасными (хлорная к-та, пероксид водорода), а в смесях с орг. в-вами - пожароопасными. Различ. несколько модификаций метода «мокрого озоления»: мин-ция серной и азотной к-тами; мин-ция серной, азотной и хлорной к-тами; мин-ция для обнар-ния ртути в объекте (част­ный метод).

II. Методы сухого озоления. В химико-токсиколог. анализе из способов «сухого озоления» в ряде случаев применяют метод сплавления с карбонатом и нитратом натрия и метод простого сжига­ния. Их исп-ют при небольш. кол-вах объекта иссл-ния, при отсутствии необходимости анализа на наличие соед-ний ртути и др. Метод сплавления с карбонатом и нитратом натрия прим-ся и как допол­нит. способ разрушения при специальных иссл-ниях на наличие в объекте мышьяка, сурьмы или для разделения свинца, бария, серебра. Особенно он удобен при анализе орг. красителей, остатков мочи, волос, ногтей и т.п. Метод простого сжигания исп-ся при иссл-нии объекта на наличие со­лей меди, марганца, висмута, цинка, фторидов и кремнефторидов.

МЕТОД ПЕРЕГОНКИ С ВОДЯНЫМ ПАРОМ (исп-ся для изол-ния летучих ядов).

Перегонка с вод. паром в химико-токсиколог. анализе исп-ся для вы­деления яд. в-в из различ. объектов (рвотные массы, пищевые продукты, внутр. органы). Этот метод может исп-ся для изол-ния в-в как с низкой, так и с высокой т-рой кипения. С пом. перегонки с вод. паром удается избежать слишком высоких т-тур, при к-х некот. в-ва могут разлагаться. Перегонка с вод. паром исп-ся для выделения из био. мате­риала ж-стей, к-е с водой образуют р-ры. Т-ра кипения таких сме­сей зависит от их состава. Чем больше ж-сти с более низкой т-рой кипения, тем ниже т-ра кипения смеси. Т-ра кипения смеси не м. б. ниже той, при к-й кипит более низкокипящая ж-сть. Это наблюдается во всех случаях, когда две ж-сти не образуют азеотропных смесей. Однако известно около 10000 си­стем, к-е образуют азеотропные смеси. Это примерно половина всех изученных смесей. Иногда, для улучшения перегонки с водяным паром некоторых в-в, добавляется третий компонент, к-й в токсиколог. химии принято называть «селективным переносчиком». Сущность такого приема заключается в том, что третий компонент по­вышает общую упругость паров в системе и этим самым позволяет снизить т-ру кипения в системе. Третий компонент может образовывать с одним из компонентов азеотропную смесь с пониженной т-рой кипения. Перегонку с водяным паром проводят в специальном приборе, состоящем из несколь­ких частей (парообразователь – колба, в к-ю вставлена пароотводная трубка и трубка паногаситель. Колба для объекта исследования помещается в нагретую водяную баню для предотвращения конденсации горячего пара. В шариковый холодильник противотоком подается холодная вода. Другая колба служит приемником дистиллята).