Работа с тест-микроорганизмами

Ампулы с лиофилизированными культурами бактерий и грибов вскрывают в асептических условиях и вносят в них около 0,5 мл соответствующей жидкой питательной среды (например, среда № 8 – для бактерий, жидкая среда Сабуро – для C.аlbicans). Полученную взвесь тест-культур переносят в пробирки с теми же жидкими питательными средами и инкубируют при соответствующей температуре в течение 24 ч (бактерии) или 48 ч (C.albicans). После 2-3-х пассажей с бульона на бульон культуру микроорганизмов пересевают с помощью бактериологической петли на питательный агар в чашках Петри для получения изолированных колоний. Выросшую культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста, изучают культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические свойства. Типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный агар того же состава и инкубируют, как было указано выше, считая полученную культуру исходной.

Культуру A.niger пересевают на агар Сабуро и инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 5-7 сут до появления конидий (экзогенных спор черного или темно-коричневого цвета).

Культуры бактерий пересевают каждый месяц, грибов – каждые 3 месяца, делая не более 5 пассажей с агара на агар, после чего используют новую ампулу или исходную культуру со среды хранения.

Тест-штаммы бактерий хранят при температуре (5 ± 1) ºС в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова.

Тест-культуру С.albicans хранят под слоем стерильного вазелинового масла на среде № 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 0,5 %. Тест-культуру A.niger хранят на среде № 2.

При пересеве культур со сред хранения предварительно удаляют слой масла над агаром, бактериологической петлей снимают верхний слой агара с выросшей культурой и переносят его в пробирки со средой № 8 для бактерий, жидкой средой Сабуро – для C.аlbicans. Посевы на среде № 8 инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС в течение 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро – при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 48 ч для C.аlbicans. Для получения конидий культуру A.niger пересевают на среду № 2 и инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 5-7 сут.

1.2.1. Приготовление спор B.subtilis

Если не удается получить гомогенную взвесь клеток B.subtilis, используют споры, получаемые следующим образом.

Культуру B.subtilis выращивают в пробирке на скошенном соево-казеиновом агаре или среде № 1 в течение 24 ч при температуре (32,5 ± 2,5) ºС. Смывают

5 мл стерильного 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида со стерильными стеклянными бусами. Взвесь бактерий переносят в матрац с 300 мл скошенного питательного агара, содержащего для ускорения спорообразования марганца сульфат в количестве 1 мг/л среды. Посевы инкубируют в течение

7 сут. при температуре (32,5 ± 2,5) ºС. Для подтверждения достаточного образования спор выросшую культуру микроскопируют. Если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 80-90 % спор, делают смыв культуры, внося в матрац 45 мл стерильного 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида. Нагревают полученную взвесь 30 мин на водяной бане при температуре 65 ºС, центрифугируют при 4300 об/мин в течение 15 мин, отмывают не менее 3 раз стерильным 0,9 % изотоническим раствором натрия хлорида до полной прозрачности надосадочной жидкости. Снова нагревают на бане при температуре 65 ºС в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин, ресуспендируют осадок (споры) в том же растворе, определяют количество спор в 1 мл чашечным агаровым методом. Хранят суспензию спор при (5 ± 1) ºС в запаянных ампулах или пробирках не менее 8 недель.