Проведение испытания. Испытание на наличие антимикробного действия проводят одним из описанных ниже методов

Испытание на наличие антимикробного действия проводят одним из описанных ниже методов.

1.3.1. Разведение лекарственного средства

Готовят необходимые разведения лекарственного средства 1:10, 1:50, 1:100,

1:500 и 1:1000 методом последовательных разведений, используя фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном рН 7,0 (п. 4.2).

1.3.2. Приготовление инокулята

24-часовые бульонные культуры бактерий на соево-казеиновом бульоне или среде № 8 и 48-часовую культуру C.albicans на бульонной среде Сабуро разводят стерильным раствором натрия хлорида 0,9 % изотоническим 1:1000 (B.cereus, C.albicans) и 1:100000 (E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus) до концентрации около 104 КОЕ/мл. Взвесь спор B.subtilis также разводят до концентрации 104 в 1 мл. Культуру A.niger смывают со скошенного агара Сабуро или со среды № 2 фосфатным буферным раствором с 0,05 % твина-80. Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру Горяева или чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации 104 КОЕ/мл.

1.3.3. Метод определения антимикробного действия в условиях испытания на микробиологическую чистоту

Каждое разведение препарата в количестве 1 мл вносят в 6 чашек Петри диаметром 90 мм, в две из которых добавляют по 0,2 мл взвеси спор B.subtilis, в две другие – по 0,2 мл взвеси культуры C.albicans, в 2 последние – 0,2 мл взвеси конидий A.niger. Чашки с бактериями заливают 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (47,5 ± 2,5) ºС питательного агара, чашки с культурами грибов – тем же количеством среды Сабуро. По 1,0 мл каждого разведения препарата вносят в пробирки с 10 мл жидких сред № 3 и № 8 (или аналогичных), куда затем добавляют по 1 мл взвеси E.coli, S.аbony, P.aeruginosa, S.aureus соответственно средам, каждый микроорганизм отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений препарата вносят такое же количество растворителя. Опыт ставят в двойной повторности. Посевы на средах № 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС в течение 48 ч (среды № 3, 8) и 5 сут (среда № 1). Посевы на среде № 2 инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 5 сут.

После окончания сроков инкубации отмечают появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках и пробирках без препарата и наличие или отсутствие роста тест-штаммов на средах с различными разведениями препарата. В случае помутнения или изменения окраски среды, затрудняющих учет результатов, делают пересевы на агаризованные среды. При росте типичных колоний E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.аureus отмечают отсутствие антимикробного действия исследуемого препарата.

1.3.4. Метод репликаций

Для водонерастворимых (суспензии, эмульсии и др.) или окрашенных соединений предпочтительно использовать метод репликаций.

В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого препарата. В контрольные чашки вносят по 1 мл разбавителя, используемого для получения разведений. В чашки Петри как в эксперименте, так и в контроле, добавляют по 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (45 ± 2) ºС соево-казеинового агара или среды № 1, в другие – такое же количество среды Сабуро и тщательно перемешивают. Опыт ставят в двойной повторности.

После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды, на которую затем бактериологической петлей, пипеткой или репликатором наносят инокулят (п. 1.3.2) каждого тест-штамма бактерий и грибов в виде бляшек на среды № 1 и № 2 (или аналогичные) соответственно. Чашки с соево-казиновым агаром или средой № 1 инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС в течение 48 ч. Чашки со средой Сабуро инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение не более 5 сут.