Выделение и идентификация культур бруцелл

Культивирование. Обычно исследуемый материал засевают в пробирку с жидкой и в не­сколько пробирок (5-10) — с агаровой питательной средой (мясо-пептонный печеночный бульон, мясо-пептонный-печеночно-глюкозный-глицериновый бульон, альбими-бульон, аналогичные агаровые среды, сывороточнокартофельный агар, сывороточно-декстрозный агар). Бруцеллы хоро­шо растут на кровяном агаре (5-10%). Загрязненный материал высевают на сывороточно-декстрозный агар с ингибиторами (рекомендация Объеди­ненного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу): генцианвиолет 1:200 тыс. или кристаллический фиолетовый 1:100 тыс., уксуснокислый натрий (0,25 мг/мл) или паранитрофенилглицерин (0,005-0,007%).

Бруцеллы — аэробы или микроаэрофилы. Температурный оптимум 37°С, диапазон - 20-40°С, оптимум рН 6,6-7,4. Микроаэрофильные свойства проявляют В. abortus и В. ovis. Поскольку не известно, какой вид бруцелл присут­ствует в исследуемом материале от крупного рогатого скота, то половину пробирок с посевами инкубируют в условиях обычной атмосферы, вторую — в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (10-12%). Посевы при исследовании на наличие В. ovis инкубируют только в атмос­фере СО₂. В первой генерации бруцеллы обладают замедленным ростом, по­этому посевы культивируют, периодически просматривая, до 30 дней. Подготовка и исследование различных материалов имеют некоторые особенности.

При исследовании абортированного плода производят посев тканевого гомогената или пастеровскими пипетками непосредственно из органов. Посевы делают из экссудата грудной и брюшной полостей, содержимого желудка, крови сердца, печени, селезенки, легких. При посеве из паренхи­матозных органов выбирают участки с фокусами некрозов, кровоизлияни­ями.

Для изготовления тканевого гомогената кусочки паренхиматозных ор­ганов обжигают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком и физиологическим раствором (1:10), гомогенат высевают на среды. Анало­гичным образом подготавливают для посева материал, взятый при диагно­стическом убое животных.

При осмотре плаценты отбирают участки с утолщенными ворсинками и стенками, с наличием гнойного экссудата. Поверхность плаценты обраба­тывают тампонами с дезинфектантами, просушивают стерильными тампо­нами, прижигают выбранный участок, вырезают необходимые фрагменты, измельчают, как было описано выше, и высевают на среды с ингибитора­ми.

Порции молока из каждой четверти вымени центрифугируют при 1000-3000 об/мин в течение 10-20 минут. Посев производят из осадка и слоя сливок на селективные среды. Рекомендуется исследовать пробы молока, взятые от животного несколько раз с интервалом 5-10 суток.

Мочу (75-100 мл) перед посевом на питательные среды центрифугиру­ют при 3000 об/мин в течение 10 минут и осадок высевают на селективные среды. Возможна концентрация бруцелл путем добавления к моче бруцеллез­ной агглютинирующей сыворотки (1-2%) с титром не менее 1:800. После непродолжительного инкубирования мочу центрифугируют и осадок высе­вают на питательные среды.

Эффективен посев в жировые куриные яйца при исследовании крови, мочи и других материалов, содержащих малое количество возбудителя. Исполь­зуют свежие куриные яйца (3-5 дней). На каждый материал берут 3-5 яиц. Исследуемый материал в количестве 0,2 мл вводят в желточный мешок, ин­кубируют при 37° С в течение пяти суток, вскрывают, набирают пастеровс­кими пипетками белок и желток и высевают на плотные и жидкие питатель­ные среды (методика Одесского ИМ имени И.И. Мечникова).

Кровь высевают сразу после взятия в жидкие питательные среды с антикоагулянтом (2%-ный цитрат натрия). В 100 мл среды засевают около 20 мл крови. В качестве питательной среды используют бульон Альбими, триптозный бульон, среду Первушина, МПБ с 1% глюкозы и 2-3% глицерина. Хо­рошие результаты получаются при посеве на комбинированные среды (ме­тод Кастанеда). Например, в колбе (пробирке) скашивают агар (ППГГА), добавляют какую-либо жидкую питательную среду, чтобы она покрывала половину поверхности агара, и в нее засевают кровь (П.А. Триленко 1976). Через 4-6 дней культивирования поверхность агара увлажняют жидкой средой и в последующем периодически просматривают с целью обнаружения колоний бруцелл.

Характер роста бруцелл на питательных средах. Колонии бруцелл появляются на поверхности плотных питательных сред на 5-10-е, реже — на 20-25-е сутки. В первичных посевах формируются, как правило, колонии S-формы: бесцветные, круглые, выпуклые, с ровными краями, гладкой маслянистой поверхностью, полупрозрачные, диаметр коло­ний в зависимости от типа питательной среды от 0,1-0,7 до 2,0-2,5 мм и более. По мере старения колонии теряют прозрачность, мутнеют и темнеют за с 1ст появления пигмента. На ППГГА в проходящем свете колонии имеют ян-гарный оттенок.

При изучении колоний в косопроходящем пучке света они имеют зеленовато-серо-голубой цвет с неболь­шим красновато-желтым центром.

При исследовании материала от животных с хроническим течением бру­целлеза могут быть выделены бруцеллы в R-форме, отличающиеся не толь­ко по форме, но особенно по характеру свечения колоний.

В жидких питательных средах бруцеллы растут с равномерным помут­нением среды, медленным появлением небольшого, голубоватого в прохо­дящем свете пристеночного кольца или кольца и поверхностной пленки. На дне пробирки постепенно образуется рыхлый осадок.

Морфология и тинкториальные свойства клеток бруцелл в культуре. Из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, Коз­ловскому. Клетки бруцелл в культуре не отличаются по морфологии от кле­ток возбудителя в исходном материале (см. выше), жгутиков не имеют.

Идентификация бруцелл на уровне рода. Принимают во внимание время появления макроскопически видимого роста, на питательных средах — потребность в СО₂. Согласно действующему в РФ «Наставлению по диагностике бруцел­леза животных» (2000), при обнаружении в посевах бактерий, типичных по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для бру­целл, проводят их серологическую идентификацию. Для целей серологи­ческой идентификации используют двухсуточные агаровые культуры ис­следуемых бактерий и диагностические агглютинирующие R- и S-сыворотки. На предметном стекле в каплях S- и R-сывороток, физиологического раствора суспензируют бактериологической петлей испытуемую культу­ру. Для контроля R-сыворотки проверяют в разведении, указанном био­фабрикой с роз-бенгал и цветным антигенами; S-сыворотки — в титре, ука­занном на коробке с цветным бруцеллезным антигеном и в неразведенном виде с роз-бенгал антигеном.

Если испытуемая культура дает положительную РА (два креста и более) с обеими или любой одной диагностической сывороткой и отрицательный ре­зультат с физиологическим раствором, то ее относят к бруцеллам.

Оценка результатов РА проводится при условии, что R- и S-сыворотки дают в контролях с гомологичными антигенами агглютинацию интенсив ностью минимум на три креста, при отсутствии реакции с гетерологичными антигенами. Агглютинация с R-сывороткой происходит замедленно, с ней всегда реагируют культуры В. ovis и В. canis.

Для идентификации выделенной культуры на уровне рода также иссле­дуют оксидазную, каталазную активность, наличие жгутиков, образова­ние индола, уреазы, способность редуцировать нитраты, агглютинировать в бруцеллезной позитивной сыворотке, а также патогенность для лабора­торных животных (см. «Биопробу»).

Бруцеллы не обладают подвижностью, образуют каталазу, обычно ок-сидазу (кроме В. ovis и В. neotomae) и уреазу (кроме В. ovis и некоторых штаммов В. melitensis), редуцируют нитраты, не образуют индол.

Наставлением по диагностике бруцеллеза животных (2000) в РФ пре­дусмотрено использование полимеразной цепной реакции.

Идентификация бруцелл на уровне вида и биовара. Критерии дифференциации видов и биоваров бруцелл представлены в таблицах.

Определение вида и биовара выделенной культуры бруцелл дает воз­можность более детально проводить эпизоотологический и эпидемиологи­ческий анализ.

Разработанные методы дифференциации видов бруцелл предполагают работу с бруцеллами в S-форме (кроме В.ovis и В. canis), поэтому перед проведением таких исследований проверяют популяцию на диссоциацию методом окраски колоний кристаллвиолетом по Уайту-Вильсону. Для этого готовят взвесь 48-часовой изучаемой агаровой культуры в стериль­ном физиологическом растворе концентрацией 0,5-1 млрд. микробных клеток в 1 мл по бруцеллезному стандарту мутности. Одну каплю взвеси засевают последовательно шпателем на поверхность агаровой среды в трех чашках Петри.

Посевы инкубируют 5 суток при 37-38°С. При таком методе посева на плотной среде вырастает достаточно большое количество изолирован­ных колоний бруцелл. В чашки Петри с колониями осторожно пасте­ровской пипеткой наливают рабочий раствор кристаллвиолета¹ тонким слоем. Через пять минут краситель осторожно отсасывают пипеткой и сливают в емкость с дезраствором. Затем колонии изучают при помощи стереоскопического микроскопа.

Диссоциированные колонии имеют цвет от темно-фиолетового до свет­ло-синего, S-колонии окрашиваются в светло-желтый, реже — в светло-зеленый цвет. Для изучения отвивают несколько колоний в
S-форме.

Таблица 68 - Дифференциация видов и биоваров рода Brucella

+ - все штаммы положительные;
(+) - большинство штаммов положительно; (-) - большинство штаммов отрицательно; - - все штаммы отрицательны; 1) концентрация красителя 1:50 000 (масса/объем), для более четкой дифференциации биоваров 3 и 6 тионин вносят в концентрации 1:25 000, при этом биовар 3 растет, а биовар 6 - нет.

У культур бруцелл в S-форме изучают: лизис под действием бруцеллез­ного фага, окисление ряда аминокислот, углеводов, потребность в СО₂, образование H₂S, уреазы, рост в средах с тионином, основным фуксином, агглютинацию с моноспецифическими сыворотками против антигенов А, М, R.

Определение потребности культур бруцелл первых генераций в СО_2. В эксикатор (другой герметически закрывающийся сосуд) с посевами до­бавляют через газомер СО₂ до содержания 5 -10%, либо в сосуд помещают крышку чашки Петри с 0,35 г Na₂CО₃ на 1000 мл объема, в эту же крышку в наклонном положении помещают пробирку Флоринского с 0,35 мл НС1, со­суд закрывают и, наклоняя его, выливают кислоту, что обеспечивает накоп­ление необходимого количества СО₂ в емкости. Параллельно культивируют посевы в условиях обычной атмосферы. Некоторые биовары В. abortus мо­гут не требовать СО₂ уже в первой генерации.

Определение образования сероводорода. Испытуемую культуру бруцелл выращивают на скошенном печеноч­ном агаре в пробирках с бумажкой, пропитанной насыщенным водным ра­створом уксуснокислого свинца. Результаты учитывают через каждые два дня в течение 6 дней.

Оксидативный метаболизм. Испытуемые культуры выращивают на сывороточно-декстрозном ага­ре 48 часов, смывают фосфатным буфером Соренсена (рН 7,0), трехкратно отмывают центрифугированием и стандартизируют до концентрации, эк­вивалентной 0,9 MrN/мл по Кьельдалю. Измерение поглощения кислорода проводят объемным респирометром с определением константы Варбурга. Поглощение кислорода выражают в виде микролитров на миллиграмм клеточного азота за час (QО2N).

Обычно используют следующие субстраты: а -аланин, а -аспарагин,
а -глу­таминовая кислота, а -аргинин, D a -цитруллин, Da-орнитин, а -лизин, аа -apaбиноза, D-галактоза, D-глюкоза, D-рибоза, D-ксилоза, мезо-эритритол. Суб­страты готовят в виде 10%-ных (вес/объем) растворов в буфере Соренсена (рН 7,0), стерилизуют фильтрацией, хранят при -20° С. Da-цитруллин стери­лизуют при 121°С 15 минут. QО₂N объем вычисляют по методу Варбурга с коррекцией на эндогенное поглощение О₂.

Определение способности к росту на питательных средах с фуксином и тионином. Используют Альбими-агар или триптозный агар с красителями в кон­центрации 1:50 000 или 1:25 000. Красители в виде 0,1%-ных растворов ки­пятят в водяной бане в течение 20 минут и затем добавляют в необходимом количестве к расплавленному стерильному агару. Засеянные культурами Чашки Петри инкубируют при 37° С в атмосфере 5-10% СО₂ в течение 4 дней. В качестве контроля на среды высевают эталонные штаммы бруцелл определенных видов. Среды хранят в холодильнике не более 10-15дней. Обесцвеченные среды использовать нельзя.

Определение уреазной активности. Рекомендуется проводить на среде Кристенсен с инкубацией при 37°С, Считывая результат через 0,5 -1 -2 -3 -4 -5 и 24 часа. На среду засевают одну бактериологическую петлю испытуемой культуры. Резуль­тат считается отрицательным, если уреазная активность не проявляется в течение 24 часов. Культуры В. suis, В. canis и В. neotomae изменяют среду В течение 15 минут. Большинство штаммов В. abortus, B. melitensis дают позитивную реакцию в интервале 1-24 часа инкубации. Культуры В. ovis — уреазонегативные.

Испытание культур бруцелл в РА с моноспецифическими сыворотками (М, A, R). Моноспецифические сыворотки получают раздельной иммунизацией кроликов соответствующими эталонными штаммами бруцелл с последующей перекрестной адсорбцией агглютининов этими же штаммами.

Густую суспензию испытуемой культуры бруцелл (~ 2 млрд. мк./мл.), выращенной в течение 48 часов на сывороточно-декстрозном агаре, про­гревают при 60° С в течение часа в 0,5%-ном феноло-солевом растворе,

смешивают каплю суспензии и каплю моноспецифической сыворотки. Ре­зультат учитывают через минуту. Эти исследования необходимо проводить с параллельным контролем в виде антигенов из эталонных штаммов В. abortus (1-й биотип), В. melitensis (1-й биотип), В. ovis и B.canis.

В определенных ситуациях возникает необходимость дифференциации

вакцинного штамма В. abortus N19 от эпизоотических штаммов этого вида бруцелл. В дополнение для этой цели предлагается исследование способности к росту на агаре, содержа­щем тионин (2 мг/мл), на агаре с эритритолом (1 мг/мл) и устойчивость к пенициллину при использовании дисков с пенициллином (5 ЕД). Культуры вакцинного штамма
В. abortus N19 не растут на средах с указанными концентрациями тионина и эритритола и чувствительны к пенициллину, в от­личие от эпизоотических штаммов.

Определение чувствительности к фагам. Тестируемые культуры должны быть в S-форме. Суспензию бруцелл го­товят как для РА и засевают сплошным газоном на плотную питательную среду. Тв-фаг стандартизуют в рутинном тесте разведения (RTD) и для тит­рования берут RTD и 10000xRTD. Также используют фаги репрезентатив­ных групп 1-5 Corbell и Thomas. Отдельные капли фага (~0,25 мкл) нано­сят на поверхность засеянного агара, инкубируют при 37° С, учет проводят через 24 часа и далее с этим же интервалом.