Тема заняття № 7. Дослідження біосинтезу і біотрансформації холестерину. Патологія ліпідного обміну

Цілі заняття:

 Трактувати етапи біосинтезу холестерину.

 Пояснювати регуляцію синтезу холестерину в організмі людини.

 Аналізувати шляхи бітрансформації холестерину: етерифікацію, утворення жовчних кислот, стероїдних гормонів, вітаміну D3; екскреція холестерину з організму.

 Пояснювати патологію ліпідного обміну: атеросклероз, цукровий діабет, ожиріння, стеаторея.

 Пояснювати процеси ліпідної пероксидації в нормі та за умов патології.

 Трактувати регуляцію вільнорадикальних реакцій в організмі людини.

Теоретичні питання

1. Біосинтез холестерину в організмі людини:

• локалізація цього процесу, значення;

• етапи синтезу холестерину;

• ферментативні реакції синтезу мевалонової кислоти;

• регуляція синтезу холестерину;

2. Шляхи біотрансформації холестерину:

• етерифікація холестерину;

• утворення жовчних кислот, значення;

• утворення стероїдних гормонів;

• синтез жиророзчинного вітаміну D3;

• екскреція холестерину з організму;

• роль цитохрому Р-450 в біотрансформації фізіологічно активних стероїдів;

3. Виявлення холестерину методами Сальковського та Лібермана- Бурхарда. Принципи методів.

4. Нормальний вміст холестерину в крові людини.

5. Патології ліпідного обміну:

• атеросклероз: механізми розвитку, роль генетичних факторів. Атеросклероз як імунозапальний процес;

• порушення ліпідного обміну при цукровому діабеті;

• патологічні процеси обміну ліпідів, які ведуть до розвитку ожиріння; стеаторея: причини та види;

• процеси ліпідної пероксидації в нормі та за умов патології;

• регуляція вільнорадикальних реакцій в організмі людини;

• характеристика антиоксидантів та прооксидантів, їх значення для протікання реакцій пероксидації ліпідів.

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення холестерину в екстрактах нервової і м’язової тканин реакцією Сальковського.

Принцип методу. При додаванні концентрованої сірчаної кислоти у розчин, що містить холестерин, відбувається розвиток червоного забарвлення, яке зумовлене утворенням дегідрохолестерину – продукту дегідратації холестерину.

Техніка роботи. У дві сухі пробірки наливають по 1,0 мл екстракту нервової і м’язової тканин і додають по 1,0 мл концентрованої сірчаної кислоти. Спостерігають виникнення забарвлення.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення визначення холестерину в сироватці крові. Збільшення вмісту холестерину в крові (гіперхолестеринемія) – найбільш достовірний фактор ризику розвитку коронарного атеросклерозу, ішемічної хвороби серця та інфаркту міокарда. Підвищення вмісту холестерину в крові спостерігається при цукровому діабеті, нефриті, нефрозі, гіпотиреозі. Зниження холестерину в крові (гіпохолестеринемія) спостерігається при анеміях, голодуванні, гіпертиреозі, паренхіматозній жовтяниці, ураженні ЦНС.

Завдання 2. Визначення процесів ліпідної пероксидаціі в тканинах.

Визначення вмісту малонового діальдегіду.

Принцип методу грунтується на тому, що за високої температури в кислому середовищі малоновий діальдегід (МДА) реагує з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) з утворенням забарвленого триметинового комплексу з максимумом поглинання за довжини хвилі 532 нм.

Техніка роботи. В 1-у пробірку наливають 3,4 мл 0,2 М трис-HCl-буфера з 0,15 М розчином KCl; в 2-у – 1,4 мл того-ж буфера и додають по 1,0 мл розчину FeSO4 та аскорбінової кислоти; в 3-ю пробірку (контрольна проба на присутність ендогенного МДА) наливають 3,4 мл буферу і додають 1,0 мл розчину трихлороцтової кислоти (ТХО), що містить ЕДТА. В пробірки вносять по 0,1 мл суспензії мітохондрій і ставлять їх в термостат при 37 ˚С. Після інкубації (15 хв) зупиняють реакцію в 1-й и 2-й пробірках додаванням 1,0 мл суміші ТХО з ЕДТА і осад в трьох пробірках відокремлюють центрифугуванням. До 2,0 мл надосадової рідини додають по 1,0 мл 0,7 %-го розчину ТБК та вміст поміщають в киплячу водяну баню на 15 хв.

Після охолодження пробірок визначають оптичну щільність на спектрофотометрі при 535 нм.

Вміст білку визначають одним з методів, що описані у відповідному розділі.

Розрахунок: Активність ліпідної пероксидації у досліджуваній пробі виражають кількістю МДА, накопленого за період інкубації, на 1 мг білка в пробі: Е535(t) – Е535(0)

Х =---------------------

А

Де Е535(t) – оптична щільність проби після інкубації; А – кількість білка в пробі,мг; Е 535 (0) – оптична щільність контрольної проби.

Кількість МДА виражають в одиницях оптичної щільності (Е535) або ураховують молярний коефіцієнт екстинції Е = 1,56 • 105 М-1•см-1.

Клініко-діагностичне значення. Процеси ліпідної пероксидації протікають в організмі здорової людини в незначній ступені. При патологічних станах: ішемії печінки та міокарду, атеросклерозі, під впливом іонізуючого опромінення тощо відбувається активація процесів ліпідної пероксидації, що приводить до порушення структури та функції біологічних мембран, до патології клітин.

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія.- Київ-Тернопіль: Укрмед-книга, 2000.-508 с.

2. Биологическая химия. Практикум. За редакцией д.мед.н., профессора

Ю.В. Хмелевського. – Київ: “Вища школа”. – 1985. – 207 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. – Київ:НМУ. – 1992.- 36с.

Додаткова:

1. Алимов Е.К., Аствацатурьян А.Т., Жаров Л.В. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний.-Москва «Медицина», 1975.-278 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.

Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

3. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. Москва «Медицина»-1983.-272 с.

4. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т.-М.: Мир. 1985. – 1056 с.

Змістовий модуль 11. Метаболізм амінокислот. Ензимопатії амінокислотного обміну.