Тема заняття № 2. Дослідження аеробного окислення глюкози та альтернативних шляхів обміну моносахаридів

Цілі заняття:

 Пояснювати механізми перетворення моносахаридів до кінцевих продуктів з звільненням енергії в аеробних умовах.

 Аналізувати структурно – функціональні особливості мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу.

 Пояснювати послідовність ферментативних реакцій та значення пентозофосфатного шляху окислення глюкози.

 Аналізувати метаболічні шляхи перетворення фруктози і галактози в організмі людини.

Теоретичні питання

1. Етапи та схема аеробного окислення глюкози.

2. Окислювальне декарбоксилювання піровиноградної кислоти:

• будова мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу;

• особливості функціонування піруватдегідрогеназного комплексу;

• механізм реакції окисного декарбоксилювання пірувату;

• роль вітамінів та коферментів в перетворенні ПВК в ацетил-КоА;

4. Сумарне рівняння та енергетика аеробного окислення глюкози:

5. Пентозофосфатний шлях окислення глюкози:

• схема реакцій окислювальної та неокислювальної стадії ПФШ;

• роль ферментів та коферментів в проходженні реакцій ПФШ;

• сумарне рівняння реакцій ПФШ;

• біологічне значення ПФШ;

5. Ферментативні реакції перетворення фруктози в організмі людини.

6. Спадкові ензимопатії обміну фруктози.

7. Ферментативні реакції перетворення галактози в організмі людини.

8. Спадкові ензимопатії обміну галактози.

Практичні роботи

Завдання 1. Вивчення процесу окислювального декарбоксил.вання пірувату.

Принцип роботи. Про протікання реакції окислювального декарбоксилювання ПВК свідчить зменшення вмісту ПВК та по накопиченню АТФ в інкубаційному середовищі.

Хід роботи. Три пробірки (одна дослідна і дві контрольні) заповнюють розчинами за наступною схемою:

Дослід К1 К2

1. Суспензія мітохондрій, мл

2. Розчин ПВК, мл

3. Фосфатний буфер, мл

4. 0,85 М розчин сахарози з ЕДТА, мл 5

- -

2 5

-

Проби індукують при 37°С 10 хвилин. Через 10 хвилин у дослідній та першій контрольній (К1) пробірках визначають кількість ПВК, і в дослідній та другій контрольній (К2) – кількість АТФ.

Завдання 2. Визначення вмісту пірувату в суспензії мітохондрій.

Принцип роботи. У лужному середовищі в присутності 2,4-динітрофенілгідразину та ПВК утворюється забарвлена сполука. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації ПВК у розчині.

Хід роботи. З дослідної та К1 пробірок перенести по 1,0 мл вмісту у дві чисті пробірки, додати по 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину та по 5,0 мл 0,4М розчину NaOH. Порівняти інтенсивність забарвлень у пробірках.

Завдання 3. Визначення вмісту АТФ в суспензії мітохондрій.

Принцип роботи. АТФ осаджують з розчину солями ртуті. Осад розчиняють у соляній кислоті та піддають короткочасному гідролізу. При цьому відщеплюється Pн і по ньому визначають кількість АТФ.

Хід роботи. З дослідної та К2 пробірок перенести у 2 чисті пробірки по 2,0 мл розчину, додати по 1 мл 20% розчину оцтовокислої ртуті. Про вміст АТФ судять по кількості осаду в пробірках.

Результати роботи занести до протоколу, зробити висновки.

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ -Тернопіль: Укрмедкнига, 2000.-508 с.

2. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. Практикум. За редакцією д.мед.н., професора Ю.В. Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1985. – 204 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. – Київ: НМУ. – 1992.- 36с.

Додаткова:

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.

Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т.-М.: Мир. 1985. – 1056 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуєлл В. Биохимия человека: В 2т.-М.: Мир, 1993.-т.1-381 с.; т.2-414 с.

Тема заняття №3. Дослідження катаболізму та біосинтезу глікогену. Регуляція обміну глікогену, біосинтез глюкози – глюконеогенез.

Цілі заняття:

 Пояснювати особливості реакцій розщеплення та біосинтезу глікогену.

 Аналізувати гормональну регуляцію обміну глікогену в м’язах та печінці.

 Пояснювати генетичні порушення метаболізму глікогену.

 Аналізувати особливості реакцій та субстрати глюконеогенезу та його регуляцію.

Теоретичні питання

1. Особливості і механізм ферментативних реакцій глікогенезу.

2. Реакції глікогенолізу і їх зв’язок з гліколізом.

3. Каскадні механізми АТФ – залежної регуляції активностей глікогенфосфорилази і глікогенсинтетази.

4. Особливості гормональної регуляції обміну глікогену в м’язах та печінці.

5. Спадкові порушення біосинтезу ферментів метаболізму глікогену.

6. Глікогенози, аглікогенози – причини їх виникнення.

7. Особливості метаболізму вуглеводних компонентів глікокон’югатів та генетичні порушення їх обміну.

8. Фізіологічне значення, метаболічні шляхи та субстрати глюконеогенезу.

9. Напрямки регуляції глюконеогенезу в організмі людини.

Практичні роботи

Завдання 1. Вивчення розпаду та біосинтезу глікогену в печінці.

Принцип роботи. Найбільш активно розпад та біосинтез глікогену проходить в печінці. Глікоген виявляється за рахунок його властивості утворювати з йодом забарвлені сполуки. Забарвлення від яскраво-червоного до червоно-бурого виникає в результаті утворення нестійкої адсорбційної сполуки глікогену з йодом.

Хід роботи:

0,5 г печінки розміщують в фосфорній чашці, додають 5 мл киплячої дистильованої води і кип’ятять 3 хвилини. Тканину печінки розтирають в фосфорній ступці, додають 2 мл води, 5 крапель оцтової кислоти і кип’ятять 10 хвилин. Осад білків відфільтровують. Утворений гідролізат досліджують.

Завдання 2. Виявлення глікогену в печінці тварин при нормальному раціональному харчуванні та в стані голоду.

Принцип методу. Якісно реакцією на глікоген печінки є реакція на раніше підготовлений гідролізат.

Хід роботи:

До 0,5 мл гідролізату печінки додають 3 краплі розчину йоду. При наявності в печінці глікогену розчин буде мати характерний червоний колір.

Результати досліду заносити в таблицю:

Досліджувана печінка Якісна реакція на глікоген

1. Тварин при раціональному харчуванні

2. Тварин в стані голоду

Зробити висновки.

Література

Основна:

4. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмед-книга, 2000.-508 с.

5. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. Практикум. За редакцією д.мед.н., професора Ю.В. Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1985. – 204 с.

6. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. – Київ: НМУ. – 1992.- 36с.

Додаткова:

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.

Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т.-М.: Мир. 1985. – 1056 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуєлл В. Биохимия человека: В 2т.-М.: Мир, 1993.-т.1-381 с.; т.2-414 с.

Тема заняття № 4. Дослідження механізмів метаболічної та гормональної регуляції обміну глюкози крові. Цукровий діабет.

Цілі заняття:

 Проаналізувати основні джерела та шляхи використання глюкози крові.

 Пояснювати роль гормонів в підтримці постійного рівня глюкози в крові.

 Пояснювати порушення метаболізму вуглеводів при цукровому діабеті.

Теоретичні питання

1. Схема біохімічних процесів, що забезпечують постійний рівень глюкози в крові.

2. Гормони – регулятори обміну глюкози в організмі.

3. Механізми впливу гормонів на рівень глікемії.

4. Характеристика гіпер-, гіпоглікемії та глюкозурії.

5. Методи визначення вмісту глюкози в крові.

6. Інсулінзалежна та інсуліннезалежна форми цукрового діабету.

7. Біохімічна характеристика та діагностичні критерії цукрового діабету.

8. Використання глюкозотолерантних тестів та подвійного цукрового навантаження для вивчення обміну вуглеводів в організмі людини.

9. Значення визначення вмісту сіалових кислот в крові для діагностики захворювань.

Практичні роботи

Завдання 1. Кількісне визначення вмісту глюкози в крові методом В.К. Городецького.

Принцип роботи. Реакція заснована на властивості глюкози окислюватись глюкозооксидазою в глюконову кислоту. Пероксид водню, що утворився розщеплюється пероксидазою і відбувається окислення ортотолуідину. Кількість окисленого фарбника прямо пропорційна концентрації глюкози в крові.

Хід роботи. До 1,0 мл безбілкового фільтрату крові додають 1,5 мл робочого розчину, який містить препарати глюкозооксидози, пероксидази та о-толуідину та 1,5 мл ацетатного буферу.

Спостерігають розвиток синього забарвлення. Результати заносять до таблиці:

№ і вміст пробірок Інтенсивність забарвлення

з реактивом на глюкозу

Безбілковий фільтрат крові:

№1 – здорової людини

№2 – хворого на цукровий діабет

Зробити висновки.

Завдання 2. Розрахунок вмісту сіалових кислот при нагріванні в крові за методом Геса.

Принцип роботи. Сіалові кислоти при нагріванні з реактивом Геса дають буро-рожеве забарвлення, інтенсивність якого прямо пропорційна концентрації сіалових кислот і визначається фотоелектроколориметричним методом.

Практична частина роботи виконана лаборантами. Студенти виконують останній етап роботи – проводять розрахунок вмісту сіалових кислот в крові двох людей.

Отримані після фотометрії на ФЕКу дані (величина екстинкції) занести в таблицю:

Досліджуваний об’єкт Екстинкція Умовні одиниці

1. Кров здорової людини

2. Кров хворої людини 0,175

0,320

Примітка. Величину екстинкції помножують на 1000.

Зробити висновки.

В нормі вміст сіалових кислот 100 – 195 умовних одиниць, що відповідає 500 – 790 мг/л (55 – 79 мг %).

Література

Основна:

7. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмед-книга, 2000.-508 с.

8. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. Практикум. За редакцією д.мед.н., професора Ю.В. Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1985. – 204 с.

9. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. – Київ: НМУ. – 1992.- 36с.

Додаткова:

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини.

Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т.-М.: Мир. 1985. – 1056 с.

Змістовий модуль 10. Метаболізм ліпідів та його регуляція

Тема заняття № 5. Дослідження біосинтезу триацилгліцеролів та фосфоліпідів. Внутрішньоклітинний ліполіз та його регуляція.

Цілі заняття:

 Трактувати біохімічні функції простих і складних ліпідів в організмі: участь в побудові та функціонуванні біологічних мембран клітин, запасна, енергетична функції, використання в якості попередників в біосинтезі біологічно активних сполук ліпідної природи.

 Пояснювати основні шляхи внутрішньоклітинного метаболізму ліпідів.

 Пояснювати ферментативні реакції катаболізму та біосинтезу триацилгліцеролів.

 Трактувати ферментативні реакції синтезу фосфоліпідів та сфінголіпідів.

 Аналізувати основні шляхи метаболізму ліпідів в умовах нормального функціонування людського організму та при патології.

 Пояснювати гормональну регуляцію обміну ліпідів.

Теоретичні питання

1. Біологічні функції простих і складних ліпідів в організмі людини:

• участь ліпідів у побудові та функціонуванні біологічних мембран клітин. Рідинно-мозаїчна модель біомембран. Ліпосоми. Використання ліпосом в медицині;

• запасна функція ліпідів;

• енергетична функція ліпідів;

• використання ліпідів в якості попередників в біосинтезі біологічно активних сполук ліпідної природи;

• використання ліпідів для синтезу жовчних кислот;

• участь ліпідів в терморегуляції;

2. Адипоцити жирової тканини та їх роль в обміні ліпідів і біоенергетичних процесах в організмі.

3. Основні шляхи метаболізму ліпідів в організмі людини.

4. Катаболізм триацилгліцеролів:

• характеристика внутрішньоклітинного ліполізу, його біологічне значення;

• ферментативні реакції;

• механізми регуляції активності триацилгліцеролліпази;

• нейрогуморальна регуляція ліполізу за участю адреналіну, норадреналіну, глюкагону, інсуліну;

• енергетика окислення триацилгліцеролів;

5. Біосинтез триацилгліцеролів та фосфоліпідів:

• ферментативні реакції синтезу триацилгліцеролів;

• ферментативні реакції синтезу фосфоліпідів;

• значення фосфатидної кислоти у синтезі триацилгліцеролів та фосфоліпідів;

• ліпотропні сполуки, їх значення у синтезі фосфатидилхоліну;

6. Метаболізм сфінголіпідів. Генетичні аномалії обміну сфінголіпідів – сфінголіпідози.

7. Принципи методів визначення фосфоліпідів в мінералізатах тканин та загальних ліпідів у сироватці крові.

Практичні роботи

Завдання 1. Якісне визначення фосфоліпідів в мінералізатах тканин по фосфору.

Принцип методу. Під час мінералізації тканин фосфор органічних сполук вивільняється у вигляді неорганічного фосфору (Рн). Визначення фосфату основане на кольоровій молібденовій реакції (молібденовокислий амоній) у присутності відновника аскорбінової кислоти.

Техніка роботи. У три пробірки наливають по 1,0 мл мінералізату мозку, печінки, серця і додають у кожну пробірку по 1,0 мл молібденовокислого амонію та аскорбінової кислоти. Інтенсивність забарвлення пропорційна вмісту фосфату в мінералізаті.

Результати вносять до таблиці:

№ пробірки Досліджуваний мінералізат тканин Інтенсивність забарвлення розчину (після того, як додали молібдат амонію і аскорбінову кислоту) Висновки

3 Мозку

печінки

серця

Завдання 2. Визначення загальних ліпідів у сироватці крові.

Загальні ліпіди в крові представлені нейтральними жирами, вільними жирними кислотами, фосфоліпідами, холестерином, липопротеїнами різної щільності і є показниками ліпідного обміну.

Принцип методу. Після экстрагування ліпідів із сироватки крові сумішшю спирту з ефіром і при взаємодії екстракту з сірчаною кислотою утворюється мутна емульсія, оптичну щільність якої вимірюють за допомогою фотоелектроколориметру.

Порядок виконання роботи. В пробірку наливають 0,2 мл сироватки крові, добавляють 3,8 мл суміші Блюра, струшують і поміщають пробірку у водяну баню (50-60ºС, але не вище 80 ºС), доводячи її вміст до кипіння. Після охолодження пробірки під течією холодної води вміст фільтрують через паперовий фільтр у мірну пробірку. Об’єм отриманого екстракту доводять сумішшю Блюра до 4,0 мл. Відміряють 2,0 мл отриманого екстракту (0,1 мл сироватки крові) і добавляють до нього 10,0 мл 1% розчину сірчаної кислоти, пробу ставлять у кипящу водяну баню на 1 хвилину, охолоджують і через годину визначають оптичну щільність розчину на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 630 нм (червоний світофільтр) в кюветі на 10 мм проти контролю (2,0 мл суміші Блюра і 10,0 мл 1% розчину сірчаної кислоти). Кількість загальних ліпідів в пробї знаходять по калібровочній кривій або по формулі:

Загальні ліпіди в г/л = Е дос • С ст

Е ст

де Е –екстинкція дослідних і стандартних проб; С- концентрація основного стандартного розчину. Коефіцієнт для переведення в г/л дорівнює 0,01. Загальні ліпіди в сироватці крові складають 4-8 г/л.

Побудова калібровочної кривої. Калібровочну криву будують по суміші холестерину з тваринним жиром у співвідношенні 1:3. Із висушеної до постійної маси суміші холестерину з тваринним жиром (топлене вершкове масло або свинячий жир) готують 1 г/л розчин в суміші Блюра. Із цього розчину готують серію розведень: беруть по 0,2; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл і добавляють до об»єму 2,0 мл суміші Блюра – 1,8; 1,5; 1,0; 0,5; 0 мл і по 10,0 мл 1% розчину сірчаної кислоти. Кількість ліпідів при цьому в пробі (якщо в досліді 0,1 мл) – 2, 5, 10, 15, 20 в г/л. Через 1 годину фотометрують проти контролю.

Клініко-діагностичне значення. Як фізіологічне явище підвищення вмісту ліпідів у крові (гіперліпемія) наступає через 1 – 4 години після прийняття їжі. Концентрація ліпідів крові підвищується (гіперліпемія) при цукровому діабеті (до 10-20 г/л), ліпоїдному нефрозі, циррозі печінки, ожирінні, атеросклерозі, ішемічній хворобі серця, гіпотиреозі, панкреатиті.

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія.- Київ-Тернопіль: Укрмед-книга, 2000.-508 с.

2. Биологическая химия. Практикум. За редакцией д.мед.н., профессора

Ю.В. Хмелевського. – Київ: “Вища школа”. – 1985. – 207 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. – Київ:НМУ. – 1992.- 36с.

Додаткова:

1. Алимов Е.К., Аствацатурьян А.Т., Жаров Л.В. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний.-Москва «Медицина», 1975.-278 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини.

– Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

3. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. Москва «Медицина» -1983.-272 с.

3. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т.-М.: Мир. 1985. – 1056 с.