Определить осахаривающую активность ферментного препарата бактериального происхождения

В коническую колбу на 100 мл вносят 20 мл 1 % раствора крахмала, приготовленного на фосфатном буфере (рН 6), и выдерживают 10 минут в термостате при температуре 30 °С. Затем к раствору крахмала добавляют 10 мл 1 % раствора ферментного препарата, приготовленного на фосфатном буфере (рН 6) и предварительно нагретого до 30 °С. Общий объем реакционной смеси должен составлять 30 мл, поэтому недостающий объем доводят водой.

Колбу с реакционной смесью выдерживают в термостате в течение 10 минут для гидролиза и осахаривания крахмала. Затем в колбу с реакционной смесью вносят 2 мл 1 н раствора соляной кислоты для инактивации фермента.

В полученном гидролизате определяют содержание редуцирующих сахаров. Для этого гидролизат количественно переносят в коническую колбу для титрования на 250 мл. В колбу пипеткой вносят 10 мл 0,1 н раствора йода и сразу за этим – 26,3 мл 0,1 н раствора едкого натра (щелочь вносят по каплям при перемешивании!). Полученный опытный раствор оставляют в темном месте на 15 минут, а затем нейтрализуют 1 мл 25 % раствора серной кислоты. Избыток йода оттитровывают 0,1 н раствором тиосульфата натрия.

Одновременно готовят контрольный раствор. В колбу на 250 мл вносят 20 мл 1 % раствора растворимого крахмала, 2 мл 1 н раствора соляной кислоты, а также такой же, как и для опытного раствора, объем раствора ферментного препарата (10 мл). Затем в колбу пипеткой вносят 10 мл 0,1 н раствора йода и сразу за этим – 26,3 мл 0,1 н раствора едкого натра (щелочь вносят по каплям при перемешивании!). Спустя 15 минут выдержки в темном месте контрольный раствор нейтрализуют 1 мл 25 % раствора серной кислоты. Избыток йода оттитровывают 0,1 н раствором тиосульфата натрия.

По разности объемов тиосульфата натрия, использованного на титрование контрольного и опытного растворов (эта разность должна составлять от 1 до 4 мл!), оценивают число микроэквивалентов гидролизованных гликозидных связей – единиц активности (е) в процессе осахаривания крахмала (табл. 4).

Таблица 4* – Зависимость числа единиц активности (е) (микроэквивалентов гидролизованных гликозидных связей) от разности объемов 0,1 н раствора тиосульфата натрия при титровании контрольного и опытного растворов (∆V Na₂S₂O₃)

* Таблица составлена на основе экспериментальных данных.

Осахаривающая активность (ОС) определяется по формуле:

ОС = , ед/г (1.13)

где е – число единиц гидролизованных гликозидных связей, найденных по таблице 4;

m₂ – количество ферментного препарата в растворе, использованном в эксперименте, г;

t – длительность гидролиза (10 минут).

Отклонения при параллельном определении могут составлять не более 10 %.

Результаты измерений и расчетов заносят в таблицу 5.

Таблица 5 – Результаты эксперимента