Глава 4 хромосомы

4.1. Упаковка генетического материала

Если всю ДНК одной клетки вытянуть в одну линию, то ее длина была бы 1,74 м. Представлен­ной в виде линии суммарной ДНК одного челове­ка можно три раза обернуть земной шар по эква­тору. Поэтому хромосомы ядер клеток должны представлять собой сильно конденсированные структуры ДНК. При конденсации происходит уменьшение продольных размеров молекулы ДНК в десятки тысяч раз за счет образования сверхспи­ралей ДНК.

У эукариотических организмов значительная часть ДНК окружена множеством различных бел­ков. Эти белки вместе с ДНК образуют комплекс­ную структуру — хроматин, который обеспечива­ет специфический для эукариот тип регуляции экс­прессии генов. В состав хроматина входят очень длинные двухцепочечные молекулы ДНК и белки гистоны, кислые белки и небольшое количество РНК- Всего известно пять типов гистонов: HI, H2A, Н2В, НЗ, Н4. Гистоны объединяют несколько групп основных белков. HI наиболее слабо свя-

зан с хроматином. Ядра нуклеосом состоят из гис-тонов 4-х классов: Н2А, Н2В, НЗ, Н4. Высокая кон­сервативность свидетельствует об идентичности функций этих белков у всех эукариот.

В хромосоме ДНК с помощью гистонов упако­вана в специальные регулярно повторяющиеся структуры — нуклеосомы. Так образуется струк­тура, похожая на бусы, где каждая бусина — нук-леосома (диаметр около 10 нм). Нуклеосома пред­ставляет собой сегмент ДНК длиной около 200 пар оснований, навитый на белковую сердцевину, со­стоящую из восьми молекул белков-гистонов. Нук-леосомный кор (минимальная нуклеосома) «мас­кирует» 146 пар оснований ДНК. В нуклеосом-ную сердцевину (нуклеосомный кор) входит по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ, Н4. Поверхности этих белковых молекул несут положительные за­ряды и образуют стабилизирующий остов, вокруг которого может закручиваться отрицательно за­ряженная молекула ДНК. Гистон HI размещает­ся на участках ДНК, соединяющих одну нуклео-сому с другой. ДНК этих участков называют со­единительной, или линкерной. Предполагают, что HI, возможно, регулирует транскрипционную ак­тивность хроматина и не участвует в стабилиза­ции структуры хромосомы. Нуклеосомы, в свою очередь, упакованы в фибриллы, которые распо­лагаются в хромосоме в виде хроматиновых пе­тель. Хроматида построена из хроматиновых пе­тель. Способ упаковки хроматина представлен на рис. 4.1.

Митотическая хромосома состоит из двух сес­тринских хроматид и центромеры. В зависимости от расположения центромеры хромосомы морфоло­гически разделяют на метацентрические — центро­мера расположена посередине хромосомы, субметацентрические — больше смещена к одному из краев и телоцентрические — центромера располо­жена в теломерном (концевом) участке хромосомы (рис. 4.2).

4.2. Организация генов

Хромосома состоит из одной единственной мо­лекулы ДНК, содержащей множество генов. Гап­лоидный набор хромосом человека содержит 3,5х10⁹ нуклеотидных пар, этого достаточно для кодирования 1,5 млн. пар генов. Однако данные по изучению генома человека показывают, что ор­ганизм человека имеет не более 100 тысяч белков. Это значит, что в клетках человека только 1% ДНК кодирует образование белков. В отношении ос­тальных 99% существуют разные гипотезы. Некото­рая часть не транслируемых последовательностей ДНК регулирует экспрессию генов в ходе разви­тия, дифференцировки и адаптации. Другая часть избыточной ДНК входит в состав интронов, неко-дирующих участков генов, разделяющих кодиру­ющие области. И все же большая часть избыточ­ной ДНК представлена многочисленными семей­ствами повторяющихся последовательностей. ДНК генома эукариот можно разделить на два класса последовательностей: уникальные (неповторяющи­еся) и повторяющиеся (повторы) последовательности ДНК. К первому относятся однокопийные гены, кодирующие белки. Класс повторяющихся последовательностей ДНК представлен повтора­ми, которые встречаются у человека от 2 до 10⁷.

У человека выделяют структурные гены, функ­ционирование которых тесно связано со специфи­ческими последовательностями в молекуле ДНК, называемые регуляторными участками (рис. 4.3).

Структурные гены подразделяют на незави­симые гены, повторяющиеся гены, кластеры ге­нов, прерывистые гены:

независимые гены — транскрибируются не­зависимо, их транскрипция не связана с другими генами. Однако их активность может регулиро­ваться, например, гормонами;

повторяющиеся гены — в хромосомах один ген может находиться в виде повторов, повторя­ясь много сотен раз, вплотную следуя друг за дру­гом, образуя тандемы. Пример, гены рРНК;

кластеры генов — группы различных генов, находящиеся в определенных участках или локу-сах хромосом, объединенных общ ими функциями. В геноме человека, например, кластеры гистоно-вых генов повторяются до 10—20 раз, образуя тан-демные группы повторов. Между генами, объеди­ненными в кластере общими функциями, находят­ся спейсерные участки. Спейсерная ДНК не всег­да транскрибируется. Иногда эти участки несут информацию о регуляции или инициации тран­скрипции, но в основном это просто короткие повто­ры избыточной ДНК, роль которой не выяснена.

Отличительная черта строения многих генов эукариот — мозаичность (прерывистость) струк­туры смысловой части генов (рис. 4.4).

Это отличие связано с чередованием смысло­вых участков, несущих информацию о последо­вательности аминокислот в белке — экзонов, и участков некодирующих последовательностей, ко­торые по длине значительно больше экзонов — интронов. В результате общая длина гена оказы­вается больше, чем можно было ожидать, пример­но, в 5-7 раз.

В начале гена (до его смысловой части) нахо­дятся участки, которые обеспечивают правильную регуляцию работы гена. Их делят на две группы: неспецифические (одинаковые для всех генов) и специфические (характерные только для данного гена). Неспецифические регуляторные участки у эукариот называют «TATA-БОКС» (рис. 4.5). В них чередуются тимин и аденин. Этот участок ле­жит на 30 нуклеотидов левее начала считывания гена. Установлено, что РНК-полимераза так ло­жится на ДНК, что ее опознающая часть закрыва­ет TATA-БОКС, а активный центр РНК-полиме-разы оказывается над первым считываемым ну-клеотидом. Далее следует промоторный участок, состоящий из сайта-узнавания, сайта-связывания и сайта-инициации (А или Г) транскрипции. Ком­бинация нуклеотидов в промоторе такова, что если рамка считывания устанавливается неверно, то по­лучается последовательность, характерная для стоп-кодонов, и транскрипция останавливается. За промоторным участком следует палиндром («пере­вертыш»), или инвертированный повтор. Это двух-цепочечная последовательность ДНК, которая одинаково читается в обоих направлениях («ка­зак» — справа налево и слева направо читается одинаково). Иногда такую последовательность на­зывают «областью с двойной симметрией», где осью симметрии является центральная точка, от­носительно которой последовательность остается одинаковой. Важное свойство палиндромов — воз­можность образовывать шпильки в РНК или структуры креста — в ДНК.

Если рамка считывания установлена невер­но, то палиндром ДНК превращается в «крест», что делает невозможным дальнейшее продвиже­ние фермента. Иногда палиндромы могут нахо­диться в конце гена после его смысловой части и также, образуя «крест», будут прекращать синтез мРНК. Смысловая часть гена, как мы уже писа­ли выше, состоит из чередующихся интронно-эк-зонных последовательностей. В структурной час­ти гена расположены промотор и палиндром.

В последнее время выделяют включения спе­цифической регуляции гена — энхансеры. Они расположены впереди гена на расстоянии "в сот­ни и тысячи нуклеотидных пар. У эукариот су­ществуют специальные регуляторные белки, опоз­нающие энхансер и присоединяющиеся к нему. Та­ким образом происходит активизация гена.

Геном образован не только ядерными, но и цитоплазматическими генами. В геноме гены вы­полняют разные функции. В зависимости от вы­полняемых функций гены подразделяют на обя­зательные гены, они кодируют жизненно важ­ные функции в клетках всех типов (иногда их на­зывают генами «домашнего хозяйства»), струк­турные гены, регуляторные гены,

пунктуацион­ные гены.

4.3. Дополнение. Геномная дактилоскопия

В 1987 г. впервые была проведена идентифи­кация личности по анализу ДНК (геномная дак­тилоскопия). Это стало возможным благодаря от­крытию Элика Джеффриза в 1985 г., связанному с обнаружением у генов человека структурного полиморфизма определенных тандемов, которые образуют «картину», специфичную для молекулы ДНК конкретного человека.

Тандемные последовательности состоят из мно­гократно повторенных единиц, чаще богатых ГЦ парами. Частота повторов варьирует у различных индивидуумов от 14 до 300 раз.

Процесс идентификации ДНК сложен, но вы­сокоэффективен. Процесс начинается с выделения ДНК, с последующей ферментативной обработкой специфическими рестриктазами, которые разреза­ют ДНК на отрезки. Отрезки группируют по раз­мерам, а потом их идентифицируют радиоактив­ными маркерами — зондами. Зонды искусственно синтезируют и радиоактивно метят по фосфору, они содержат определенные последовательности (ми-нисателлиты), богатые ГЦ нуклеотидными пара­ми. Таким образом, используя один зонд, можно наблюдать за наследованием большого количест­ва аллелей (рис. 4.6).

Получаемый сложный набор вариабельных по­лос и заключает в себе специфическую картину ге­номного «дактоотпечатка» (DNA fingerprint), ал­лели, формирующие эту картину, стабильны в со­матических и зародышевых клетках и наследуются в соответствии с законами Менделя.

Это метод часто применяется для установле­ния отцовства, т.к. практически все полосы геном­ного отпечатка данного человека должны выяв­ляться в отпечатках либо его матери, либо отца. Около половины всех полос должны иметь отцов­ское происхождение. Случайное появление или от­сутствие полос маловероятно. Если предположить, что скорость мутирования равна Ю^-4 т.п.н., то при использовании всех трех проб разрешению под­даются в среднем 15 фрагментов отцовского про­исхождения в диапазоне длин 4-20 т.п.н. Вероят­ность того, что предполагаемый отец будет слу­чайно иметь 15 фрагментов < 4 х 10~^п, в случае,

если он родственник истинного отца, то вероят­ность совпадения фрагментов равна < 10~⁵.

Весь процесс диагностирования продолжите­лен во времени (от 3-х до 4-х недель) и достаточно дорогостоящий. В настоящее время можно вос­пользоваться услугами такой диагностики в ме­дицинских и юридических целях (установление от­цовства, идентификация преступных или разыс­киваемых лиц).

Громадное преимущество генетического мето­да опознания — это небольшое количество био­материала: следы кожных покровов, корни волос, высохшие капли крови и т.д., в этих случаях сна­чала проводят ПЦР (см. раздел 3.4).

4.4. Кариотип человека

Кариотип — совокупность признаков хромо­сомного набора: форма хромосом, их количество, размеры, характерные для каждого вида.

Препараты хромосом человека можно приго­товить из всех тканей и клеточных суспензий, со­держащих делящиеся клетки. Но чаще препара­ты метафазных хромосом готовят из лимфоцитов периферической крови, которые предварительно культивируют в присутствии митогена (вещество, способное индуцировать митоз, в частности, фи-тогемагглютинин). Этот метод был предложен Мурхедом с соавт. в 1960 г.

Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хромосом человека была выработа­на на международных совещаниях, созывавших­ся в Денвере (I960), Лондоне (1963) и Чикаго (1966). Согласно рекомендациям этих конференций, хро-

мосомы располагаются в порядке уменьшения их длины. Все хромосомы разделены на семь групп, которые были обозначены буквами английского алфавита от А до G. Все пары хромосом было предложено нумеровать арабскими цифрами.

Группа А (1—3) — самые крупные хромосомы. Хромосомы 1 и 3 — метацентрические, 2 — суб-метацентрическая. Группа В (4—5) — две пары довольно длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6—X—12) — хромосомы средних разме­ров. Хромосомы 6, 7, 8 и 11 больше похожи на метацентрики (центромерный индекс 40-30%). Хро­мосомы 9, 10 и 12 — субметацентрики. Х-хромосома по размеру и морфологии сходна с хромосо­мами 6 и 7. Группа D (13—15) — акроцентрические хромосомы средних размеров. Группа Е (16— 18) — довольно короткие хромосомы. Хромосома 16 более метацентрична, часто на промаксималь-ном конце длинного плеча имеется вторичная пе­ретяжка. Группа F (19—20) — самые маленькие метацентрики, практически между собой не раз­личимы. Группа G (21—22) — две пары самых мелких акроцентрических хромосом. Y-хромосома выделяется как самостоятельная (рис. 4.7, 4.8).

При этом хромосомы различных групп хоро­шо отличаются друг от друга, в то время как внут­ри группы их невозможно различить, за исключе­нием группы А.

В начале семидесятых годов был разработан метод дифференциальной окраски хромосом, ко­торый позволил идентифицировать каждую из хромосом. На рис. 4.9 показана хромосома 1-го человека с изображением дифференциального ок­рашивания и нумерации сегментов.

Каждая хромосома человека содержит толь­ко ей свойственную последовательность полос, что позволяет точно идентифицировать каждую хро­мосому и с более высокой точностью определить, в каком сегменте произошла перестройка. Поперечная исчерченность хромосом есть результат неравномерной конденсации гетеро- (высокоспирализованная ДНК) и эухроматина (релаксиро-ванная ДНК) на протяжении всей длины хромо­сомы, отражающий порядок расположения генов в молекуле ДНК

Хромосомы в метафазе максимально конден­сированы, в профазе и прометафазе более рас­плетенные, что позволяет выявлять еще большее количество сегментов — 800-1200, некоторые ав­торы описывают более 2000. Этот метод использу­ют для более точной идентификации точек разры­вов хромосом и микроделеций (рис. 4.10).

На метафазной хромосоме.(рис. 4.10, 1М) сле­ва приведены символы, которыми принято обозначать короткие (р) и длинные (q) плечи хромо- I сом, а также номера расположения сегментов. Эти обозначения используются при описании карио-типа. Сначала указывают общее число хромосом и набор половых хромосом, затем отмечается, ка­кая хромосома лишняя или какой не хватает.

Указывается номер хромосомы и обозначает­ся плечо, в котором произошли изменения (сим­волы хромосомных аберраций см. в гл. 12), после написания символа плеча указывается номер сег­мента. Например:

В настоящее время существуют ДНК-марке­ры (или зонды) для многих еще более мелких сег­ментов практически всех пар хромосом. С помощью таких ДНК-зондов можно точно оценить наличие или отсутствие определенного, даже очень малень­кого, сегмента в хромосоме (рис. 4.11).

4.5. Дополнение. Феномен ассоциаций акроцентрических хромосом человека

Среди разновидностей неслучайного располо­жения хромосом в метафазе выделяют феномен центромерных ассоциаций (рис. 4.12).

Феномен ассоциации акроцентрических хромо­сом (ААХ) был впервые описан в 1961 г. M.A.Fer-gusson-Smith and S.D.Handmaker и получил название «спутничная ассоциация». Способность ак­роцентрических хромосом вступать в спутничные ассоциации была подтверждена многими иссле­дователями (Прокофьева-Бельговская А.А. и др., 1969; Захаров А.Ф. и др., 1982 и др.).

Феномен ААХ привлекает пристальное внима­ние в связи с ядрышкообразующей функцией ак­роцентрических хромосом. С активностью ядрыш­ка связывают процесс синтеза рРНК, из которой впоследствии формируются в цитоплазме рибосо­мы (рис. 4.13), а также и другие важные процессы функционирования ядра,.такие как транспорт раз­личных видов РНК из ядра в цитоплазму, поэто+ му ААХ рассматривают как специфический пока­затель структуры и функции интерфазного ядра.

Уже в первых исследованиях было установле­но, что феномен ААХ связан с ядрышкообразу­ющей функцией акроцентрических хромосом в про­фазе митоза, когда еще сохраняется ядрышко и спирализация хромосом только начинается, оста­точное ядрышко обычно связано со спутничными

районами коротких плечей акроцентрических хро­мосом. Позже было показано, что короткие плечи всех 10 акроцентрических хромосом человека содер­жат 3 сегмента: Р1 — проксимальная часть, при­легающая к центромере; Р2 — спутничная нить, в районе которой располагается ядрышковый орга­низатор (ЯОР); РЗ — маленькое гетерохроматичес­кое тельце, содержащее теломеру короткого пле­ча (Paris Conferens, 1971).

Одна из первых гипотез, объясняющих приро­ду ААХ, была сформулирована А.А.Прокофьевой-Бельговской (1966): специфическая ориентация ак­роцентрических хромосом является следствием со­матической конъюгации гомологических участков. Конъюгация происходит за счет относительной го­мологии амплифицированных участков ДНК, рас­положенных в коротких плечах ААХ. Благодаря этому свойству гетерохроматиновых районов в ин­терфазном ядре формируются хромоцентры из го­мологичных и негомологичных хромосом, что спо­собствует определенной их упорядоченности в ин­терфазном ядре, которые сохраняются во время митоза в виде неслучайного расположения в ме-тафазной пластинке.

Если гипотеза А.А.Прокофьевой-Бельговской предполагает, что «формирование общего ядрыш­ка представляет собой не причину ассоциаций, а следствие этого процесса», то противоположную точку зрения имеют авторы «нуклеолярной гипо­тезы» M.A.Fergusson-Smith and S.D.Handmaker. Они полагают, что если ядрышки в интерфазном ядре имеют тенденцию к слиянию, то этот процесс приводит к ААХ. По мнению многих исследовате-

лей, частота ядрышек в интерфазе высоко корре­лирует с числом ААХ (Гиндилис В.Я., 1967; Ми-кельсаар А.В., 1979 и др.).

Данные последних лет о химическом составе хромосом, их молекулярной организации, строе нии и функции ЯОР акроцентрических хромосом человека позволяют сделать заключение, что «конъ-югационная» и «нуклеолярная» гипотезы о при­роде ААХ не взаимоисключают, а взаимодопол­няют друг друга.

По мнению исследователей, частота ААХ в популяции лимфоцитов является более информа­тивным показателем, чем аберрации хромосом, так как она отражает все процессы жизнедеятель­ности клеток. Образование ААХ в интерфазе яв­ляется нормальным и физиологическим процес­сом. Частота ААХ в лимфоцитах тесно связана с их иммунореактивностью, что постоянно наблю­дается при развитии иммунных реакций, так как этот показатель характеризует пролиферативную активность лимфоцитов (Фролов А.К. и др., 1993). Все это позволяет широко применять метод учета ААХ как иммуноцитогенетический тест.

4.6. Задание

1. Что такое хромосома? хроматида? хромонема? хроматин? хромомера?

2. На каких стадиях митоза хромосомы хоро­шо видны? Ответ обоснуйте.

3. Что такое кариотип? Выберите правильный ответ: а) совокупность всех признаков и свойств организма; б) совокупность хромосом, характерных для данного вида; в) совокупность всех генов организма.

4. По какому признаку отличаются кариоти-пы мужчины и женщины: а) по количеству ауто-сом; б) по количеству гетерохромосом; в) по фор­ме гетерохромосом; г) по гетерохромосомам; д) по соотношению аутосом и Х-хромосом?

5. Могут ли быть в кариотипе человека 30 хро­мосом отцовскими? Ответ поясните.

6. Объясните, чем различаются между собой следующие кариотипы: 47, XY, +21; 46, ХХ,-р21; 46, XX; 46, XY,+q21.