Практическая работа. Работа 1.Используя таблицы, разобрать принципы и возможности цитогенетических методов исследования в генетике человека

Работа 1. Используя таблицы, разобрать принципы и возможности цитогенетических методов исследования в генетике человека.

К цитогенетическим методам исследования относятся:

1. Микроскопическое изучение кариотипа человека в норме и при патоло­гии на стадии метафазы митоза (метафазный метод);

2. Микроскопические методы определения X и У-полового хроматина в интерфазных клетках эпителия слизистой ротовой полости или в нейтрофилах (интерфазный метод).

В первом случае в зависимости от задач исследования материалом для ци-тогенетического метода могут служить лимфоциты периферической крови, клетки костного мозга, фибробласты, клетки эмбриональных тканей, хо­риона, клетки амниотической жидкости. Их выращивают в культуре на специальных питательных средах с добавлением фитогемагглютинина (ФГА), который стимулирует митотическое деление; за 1-2 часа до фикса­ции обрабатывают колхицином, разрушающим ахроматиновое веретено и останавливающим клеточное деление на стадии метафазы; затем помеща­ют в гипотонический раствор, в котором клетки набухают, в результате че­го хромосомы оказываются свободно лежащими в цитоплазме. Клеточную суспензию фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты, наносят на чистые предметные стекла и окрашивают либо рутинно (метод окраски по Гимзе), либо дифференциальными красителями. Фотографирование метафазных пластинок и последующая обработка фотографий с составлением кариограмм, в которых хромосомы распределены по группам, позволяет установить общее число хромосом и обнаружить изменение их числа или структуры в отдельных парах.

Метафазный метод хромосомного анализа применяется:

1. в диагностике хромосомных болезней, связанных с изменением числа и/или структуры хромосом;

2. в дифференциальной диагностике новообразований (лейкозы, солидные опухоли);

3. для изучения хромосомного мутагенеза (учет хромосомных мутаций) при проверке факторов окружающей среды на мутагенность;

4. в пренатальной диагностике (определение нарушений кариотипа у пло­да или пола плода).

В последнем случае используют следующие методические приемы:

• амниоцентез - чрезбрюшинный прокол плодного пузыря на 15-18-ой неделе беременности с целью получения околоплодной жидкости и на­ходящихся в ней слущенных клеток амниона и плода;

• кордоцентез - взятие крови их пуповины на 18-22-ой неделе беремен­ности;

• хорионбиопсия - взятие кусочков ворсин хориона на 7-10-ой неделе бе­ременности. Во всех трех случаях клетки культивируют для получения метафазных пластинок и анализируют кариотип плода.

Интерфазный метод хромосомного анализа используется в экспресс-диагностике численных аномалий по половьм хромосомам.

Для обнаружения У-хромосомы используются специальные флюорес­центные красители, дающие свечение при люминисцентной микроскопии.

Для выявления X-хромосом используется метод определения полового хроматина в клетках слизистой щеки. Метод основан на том, что в интерфазньгх ядрах соматических клеток нормальной женщины одна из двух X хромосом неактивна (гетерохроматинизирована) и при окрашивании выяв­ляется в виде компактной хроматиновой глыбки, называемой половым хроматином или тельцем Барра; в ядрах нормальных мужских клеток по­ловой хроматин, естественно, отсутствует. Если в организме несколько X хромосом, то активна - одна, а остальные обнаруживаются в виде допол­нительных телец Барра. Поэтому по количеству телец Барра можно судить о количестве X хромосом: число X хромосом (Nx) всегда на единицу боль­ше числа телец полового хроматина (Nб): Nx=Nб+1

Работа 2. Определение полового хроматина в ядрах клеток слизи­стой щеки.

Обкусайте слизистую оболочку щёки и сполосните рот водой. Сде­лайте легкий соскоб слизистой оболочки щеки шпателем, после чего из полученного материала приготовьте мазок на предметном стекле. Для фиксации препарата опустите его на 5-10 минут в стеклянный стакан со смесью спирта и эфира. По окончании фиксации покрасьте препарат орсеином, накройте покровным стеклом и рассмотрите под микроскопом с иммерсионным объективом.

В поле зрения увидите эпителиальные клетки слизистой оболочки с хорошо прокрашенными ядрами. В последних можно заметить половой хроматин в виде крупных хроматиновых глыбок, прилегающих к ядерной оболочке и имеющих форму овала, зубчика или диска.

Зарисуйте препарат. На рисунке должны быть обозначены: 1) цито­плазма клетки; 2) ядерная оболочка; 3) половой хроматин (если обнаружен)). Сделайте вывод об общем числе Х-хромосом в своих соматических клетках и запишите кариотип.

Работа 3. Составление и анализ кариотипа человека. Из разрезанных хромосом составьте кариотип человека согласно Денверской системе классификации и сравните его с идиограммой здоро­вого человека.

Алгоритм анализа хромосомного комплекса (кариограммы):