Принципы и методы получения клеточных культур, приготовление цитогенетических препаратов

Наиболее распространённым методом в цитогенетике человека является световая микроскопия. Электронная и конфокальная лазерная микроскопия применяется в современной цитогенетике только с исследовательскими целями.

Объектом цитогенетических наблюдений могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Каждый из этих объектов имеет преимущества и недостатки. Выбор объекта определяется целью исследования.

Большинство цитогенетических исследований выполняется на соматических клетках.

Получение препаратов митотических хромосом(лимфоциты наиболее чаще)

Первое главное условие цитогенетической диагностики — наличие делящихся клеток в цитологическом препарате.

Культуры клеток можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови. Для её получения достаточно взять 1—2 мл венозной крови и добавить её в смесь питательной среды с фитогемагглютинином. Последний вызывает иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Продолжительность культивирования составляет 48—72 ч.

Вторым методическим условием цитогенетических исследований является использование колцемида (или колхицина), разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы Колцемид добавляют в культуры клеток за 2—3 ч до окончания культивирования: митотический индекс в культуре клеток за 2—3 ч повышается в 2—3 раза. Даже без культивирования экспозиция с колцемидом увеличивает число метафаз. Хромосомы в присутствии колцемида укорачиваются за счёт продолжающейся конденсации и, следовательно, в препарате они легче отделяются одна от другой.

Следующим условием для получения хороших метафазных пластинок является гипотонизация клеток (гипотонический шок). Обычно для этого используют гипотонический раствор хлорида кальция или цитрата натрия. В гипотоническом растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся и хромосомы свободно плавают в цитоплазме.

Клеточную суспензию фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), затем суспензию центрифугируют и меняют фиксатор. Смесь клеток с фиксатором может сохраняться при температуре 4°С в течение нескольких недель. При нанесении такой суспензии на чистое предметное стекло метафазная пластинка расправляется и в её пределах располагаются отдельно лежащие хромосомы. При высыхании фиксатора клетки прочно прикрепляются к стеклу.

Окраска препаратов

Все методы окраски препаратов можно разделить на 3 группы: простые, дифференциальные, флюоресцентные.

Наиболее распространён метод окраски по Гимзе, или простая окраска, рутинная окраска. Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине. При этом контурируются центромера, спутники (иногда со спутничными нитями) и вторичные перетяжки. При простой окраске возможна только групповая идентификация хромосом, поэтому данный метод используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа.

Структурные хромосомные аномалии (делеции, транслокации, инверсии), выявляемые при простой окраске, должны быть идентифицированы с помощью дифференциальной окраски.Дифференциальное окрашивание обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающаяся в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (тёмные и светлые полосы). Протяжённость этих участков специфична для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района.

Первоначально при специальном окрашивании хромосом использовали флюоресцентное алкилирующее вещество акрихин-иприт. Этот вариант был назван Q-методом. Данный метод требует быстрой обработки препарата, что не всегда удобно. Для просмотра препарата надо пользоваться люминесцентным микроскопом.

В последующем была разработана методика дифференциальной окраски без флюоресцентных красителей. Наиболее широко используется G-окраска (Гимза). При этом хромосомы предварительно обрабатывают (либо инкубация в солевом растворе, либо обработка протеазой). Предварительная обработка частично нарушает структуру хромосом, которая в некоторых участках восстанавливается при окраске, что и придаёт хромосоме индивидуальную исчерченность, или полосатость. Механизм образования сегментов пока недостаточно ясен. Предполагается, что окрашенные сегменты — гетерохроматиновые, поздно реплицирующиеся участки хромосом с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные — эухроматиновые участки, в которых расположены кодирующие последовательности.