Методика исследования

Необходимые материалы и оборудование: среда 199, 10% раствор желатина, 5% инактивированная сыворотка человека, 0.35% раствор NaOH, тирс-буфер (рН 7,65), 0,4% раствор ЭДТА, центрифужные пробирки, центрифуга, термостат, пласт­массовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0,7 мм.

Венозную кровь смешивают с антикоагулянтом ЭДТА (рН 7.4). Эритроциты осаждают 10% раствором желатина, добав­ленным к крови из расчета 1:9. После отстаивания и осаждения эритроцитов при комнатной температуре в течение 40мии плазму, обогащенную лейкоцитами, осаждают центрифуги­рованием при 1000 об/мин в течение 7 мин. Осадок лейкоцитов ресуспензируют в 0,5 мл среды 199 с 5% инактивированной сывороткой человека, добавив 4,5 мл смеси, состоящей из 9частей 0,35% раствора NaOH и 1 части тирс-буфера (рН 7,65), для растворения эритроцитов. Лейкоциты отмывают и снова ресуспензируют в среде 199, содержащей 5% человеческой инактивированной сыворотки и 0,4% ЭДТА, затем готовят густую лейкоцитарную взвесь, которой заполняют пластмас­совые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0.7 мм

Капилляр, заполненный лейкоцитарной взвесью, прикрепляют на дно лунки глубиной 20 мм, диаметром 15 мм, которая затем заполняется средой 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин со стрептомицином по 10 000 ЕД на 1 мл среды и 5% инактивированной прогреванием при 56°С в течение часа человеческой сыворотки 1; можно также использовать сыворотку лошади, кролика, оспа и др.

Лунки диаметром 1,5 мм расположены в пластинке из ор­ганического стекла (4 ряда по 4 лунки). Заполненные средой и капиллярами с исследуемыми лимфоцитами лунки закрывают крышкой, края которой смазывают вазелином для герметизации. Всю систему помещают в термостат при 37°С, Учет реакции производят под лупой с малым увеличением. Микрометром, размеченным в окуляре, измеряют ширину и длину площади миграции лимфоцитов, которая вырисовывается под увеличением в еще своего рода "дерева", стволом которого является капил­ляр, а кроной - лимфоциты, располагающиеся вокруг капилляра

Регистрацию можно проводить с помощью планиметра и рисовального аппарата. Показатель торможения миграции выра­жают в процентах по сравнению с контролем (сравнивается площадь миграции). Уменьшение площади миграции свиде­тельствует о наличии фактора, ингибирующего ее.

РТМЛ – позволяет косвенно судить о эфекторной функции лимфоцитов и отражает ГЗТ. Кроме того, функциональное состояние CD 4+ клеток. Тестируют по цитокиновому профилю, по функциональной способности синтезировать γ – ИФН, а Тх2 – синтезировать ИЛ – 4.

3.

Для CD 8 ЦТЛ – тест цитотоксичности – клетки мишени в т.ч. различные линии опухолевых клеток меченных радиоактивным изотопом, а по количеству высвобождаемого изотопа судят о величине цитотоксической активности лимфоцитов.

Date: 2015-07-02; view: 479; Нарушение авторских прав