Практична робота. Дослід 1. Визначення вмісту білірубіну в сироватці крові

Дослід 1. Визначення вмісту білірубіну в сироватці крові.

Принцип методу. Білірубін взаємодіє з діазореактивом з утворенням азобілірубіну рожевого кольору. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації білірубіну і може бути визначена фотометрично при зеленому світлофільтрі (довжина хвилі 530-560 нм). Кон’югований білірубін дає швидку (пряму) реакцію. Реакція некон’югованого білірубіну значно повільніша. Додаванням акселераторів (кофеїн та ін.) вільний білірубін можна перевести в розчинний стан і визначити кількість загального білірубіну. При використанні буферного розчину без акселераторів визначається кон’югований білірубін, а при використанні буферного розчину з акселераторами – загальний білірубін. Кількість некон’югованого білірубіну дорівнює різниці між кількістю загального і прямого білірубіну.

Визначення вмісту білірубіну рекомендують виконувати відразу ж після отримання проб, щоб попередити його окиснення на світлі; вплив прямого сонячного світла може бути причиною 50% зниження вмісту білірубіну вже через одну годину. Проби повинні бути проаналізовані протягом 2 год з момента забору крові, якщо вони зберігаються при кімнатній температурі, і в темряві, або протягом 12 год при умові зберігання при температурі 2-8 °С в темряві. Гемоліз еритроцитів прямо пропорційно знижує показники кількості білірубіну, який визначається у сироватці крові; виражена ліпемія обумовлює підвищені показники білірубіну.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові; реагент 1 без акселератора; реагент 1 з акселератором; реагент 2; пробірки; дистильована вода; піпетки; ФЕК.

Хід роботи:

Визначення проводять за схемою:

Суміші швидко перемішують і точно через 5 хв визначають оптичну густину при зеленому світлофільтрі (560 нм) проти контрольних проб з дистильованою водою. Кількість білірубіну визначають за калібрувальною кривою.

Крива залежності оптичної густини розчину білірубіну від його концентрації

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У нормі вміст загального білірубіну становить 1,7-20,5 мкмоль/л (0,1-1,2 мг/100 мл), некон’югованого – 1,7-17,1 мкмоль/л (0,1-1,0 мг/100 мл), кон’югованого 0,86-4,30 мкмоль/л(0,05-0,25 мг/100 мл). Токсична дія високих концентрацій білірубіну крові проявляється ураженням центральної нервової системи, виникненням некротичних ділянок в паренхіматозних органах, пригніченням клітинного імунітету, розвитком анемії внаслідок гемолізу еритроцитів. Важливу роль в токсичній дії білірубіну відіграє його фотосенсибілізуюча дія. Білірубін, як метаболіт протопорфірину, одного з найбільш активних фотосенсибілізаторів, здатний, використовуючи квантову енергію світла, переводити хімічно інертний молекулярний кисень у надзвичайно активну, синглетну форму. Синглетний кисень руйнує будь-які біологічні структури, окиснює ліпіди мембран, нуклеїнові кислоти, амінокислоти білків. У наслідок активації ним перекисного окиснення ліпідів і відщеплення глікопротеїнів, а також високомолекулярних пептидів мембран виникає гемоліз еритроцитів. Нагромадження в крові білірубіну вище 27,4-34,2 мкмоль/л призводить до відкладання його в тканинах і появи жовтяниці. В залежності від причини жовтяниця може бути надпечінкова (гемолітична), печінкова (паренхіматозна), підпечінкова (обтураційна).

При гемолітичній жовтяниці печінка не встигає зв’язувати велику кількість вільного білірубіну, що утворюється внаслідок підсиленого гемолізу еритроцитів. У результаті в плазмі крові спостерігається підвищений вміст білірубіну (до 90-100 мкмоль/л) за рахунок вільного білірубіну. Така форма жовтяниці спостерігається при гемолітичній, перніціозній анемії.

При паренхіматозній жовтяниці внаслідок пошкодження гепатоцитів знижується кон’югаційна здатність печінки, знижується синтез жовчі, кон’югований білірубін частково попадає назад у кров. Білірубінемія різного ступеня, яка при цьому спостерігається, розвивається за рахунок фракції як зв’язаного, так і вільного білірубіну. Паренхіматозна жовтяниця виникає при жирових гепатозах (стеатозах), гепатитах (вірусних, токсичних), цирозах печінки.

При обтураційній жовтяниці внаслідок закупорки (камінцями, пухлиною) жовчних протоків жовч переповнює їх і попадає в русло крові. Білірубінемія, яка при цьому розвивається, характеризується значною вираженістю (до 170-700 мкмоль/л) в основному за рахунок фракції зв’язаного білірубіну.

У новонароджених внаслідок стерильності кишки білірубін не перетворюється у похідні (метаболіти), але активно всмоктується у кров, зумовлюючи гіпербілірубінемію. Крім того, у новонароджених часто спостерігається тимчасова понижена активність білірубінглюкуронілтрансферази, що є причиною жовтяниці новонароджених, яка характеризується високим вмістом у крові некон’югованого білірубіну.

Захворювання, що викликають зростання некон’югованого білірубіну: гемолітична анемія, перніціозна анемія, жовтяниця новонароджених, хвороба Жільбера, синдром Криглера-Найяра, синдром Ротора.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Поясніть принцип методу визначення вмісту білірубіну та його фракцій в сироватці крові колориметричним діазометодом. Клініко-діагностичне значення визначення фракцій білірубіну.

2. Яка концентрація білірубіну в крові здорової людини?

3. У хворого на гепатит показник де Рітіса (відношення активності АсАТ до активності АлАТ) становить 0,50. Про що це свідчить? Як внутрішньоклітинна локалізація цих ензимів впливає на зростання їх активності у крові при цитолітичних процесах різного ступеня?

4. У хворого вміст альбумінів у крові становить 15 г/л при нормі 32-55 г/л, протромбіновий час – 40 с при нормі 12-20 с. Про які біохімічні порушення це свідчить і до яких наслідків може призвести?

Приклади тестів “Крок-1”

1. У жінки віком 46 років із жовчнокам’яною хворобою, розвинулась жовтяниця. При цьому сеча стала темно-жовтого кольору, кал – знебарвлений, у плазмі крові виявлено підвищений вміст кон’югованого (прямого) білірубіну. Який вид жовтяниці можна запідозрити?

А. Гемолітичну

B. Паренхіматозну

C. Обтураційну

D. Жовтяницю новонароджених

E. Хворобу Жільбера

2. У малюка, що народився недоношеним, спостерігається жовте забарвлення шкіри та слизових оболонок. Причиною цього стану є тимчасова нестача ензиму:

А. Порфобілінгенсинтази

B. δ-Амінолевулінатсинтази

C. Гемоксигенази

D.УДФглюкуронілтрансферази

E. Білівердинредуктази

3. У хворого із жовтяницею виявлено: підвищення у плазмі крові вмісту загального білірубіну за рахунок непрямого (вільного), у калі і сечі – вмісту стеркобіліну, вміст прямого (зв’язаного) білірубіну в плазмі крові – в межах норми. Який вид жовтяниці можна запідозрити?

А. Жовтяницю новонароджених

B. Паренхіматозну

C. Механічну

D. Гемолітичну

E. Хворобу Жільбера

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Клініко-біохімічна характеристика недостатності функцій печінки за умов хімічного, біологічного та радіаційного ураження; біохімічні механізми розвитку печінкової енцефалопатії.

2. Зміни біохімічних показників при гострому гепатиті, викликаному вірусами чи алкогольною інтоксикацією, їх діагностична оцінка.

3. Зміни біохімічних показників при хронічному гепатиті, цирозі, жовчно-кам’яній хворобі, дискинезії та холециститі, їх діагностична оцінка. Зв’язок порушень екскреторної функції печінки з порушеннями процесів травлення в кишці, діагностика цих порушень.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Вінниця: Новакнига, 2009. – С. 560 -584.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Медицина, 2010. – 360 с.

6. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 320 c.

7. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко – діагностичне значення. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.

8. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 3 – 46.

Додаткова:

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 551 - 565.

2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Т.2. – М.: Мир; Бином. Лаборатория знаний, 2009. – С. 366 – 371.

Тема № 7. Дослідження процесів біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Мікросомальне окиснення, цитохром Р-450.

Мета заняття: Вміти трактувати біохімічні механізми функціонування детоксикаційної системи печінки: реакції мікросомального окиснення та кон’югації в біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Вміти пояснювати біохімічні основи розвитку недостатності функцій печінки за умов хімічного, біологічного та радіаційного ураження.

Актуальність теми: У печінці знешкоджуються ендотоксини та ксенобіотики, які є чужорідними для нормальних метаболічних шляхів, можуть змінювати і порушувати перебіг обмінних процесів, а в умовах перебігу патології лікарські засоби можуть нормалізувати метаболізм і тим самим зумовити видужування хворого Знання кінетики всмоктування, транспорту, розподілу, метаболізму речовин в організмі є основою для розробки лікарських форм із заданими властивостями.

Конкретні завдання:

Ø Трактувати роль процесів метаболізму та біотрансформації ксенобіотиків.

Ø Знати механізм дії цитохрому Р₄₅₀, та роль монооксигеназних систем у біотрансформації ендогенних та екзогенних субстратів.

Ø Трактувати фази метаболізму ксенобіотиків.

Ø Аналізувати типи реакцій кон’югації ксенобіотиків та ендогенних токсинів у гепатоцитах.

Ø Пояснювати шляхи виведення продуктів детоксикації лікарських речовин та токсинів із організму.

Теоретичні питання

1. Детоксикаційна функція печінки; біотрансформація ксенобіотиків та ендогенних токсинів.

2. Типи реакцій біотрансформації чужорідних хімічних сполук у печінці.

3. Реакції мікросомального окиснення; індуктори та інгібітори мікросомальних монооксигеназ.

4. Електронно-транспортні ланцюги ендоплазматичного ретикулуму. Генетичний поліморфізм та індуцибельність синтезу цитохрому Р-450.

5. Реакції кон’югації в гепатоцитах: біохімічні механізми реакцій з глюкуроновою кислотою, сульфатною кислотою, гліцином, метилювання, ацетилування; їх функціональне значення.

6. Виникнення і природа розвитку толерантності до лікарських засобів.