Технология рекомбинантной ДНК

Получение рекомбинантных антител предполагает, во-первых, их разнообразие по специфичности взаимодействия с антигенами, соизмеримое с количеством различных клонов В-лимфоцитов в организме и, во-вторых, их промышленную продукцию, используя в качестве продуцента модифицированные микроорганизмы или эукариотные клетки.[8]

Для получения рекомбинантных антител с разной специфичностью, с различными гипервариабельными участками в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и Fv-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli; это метод фагового дисплея.

Для этого, используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК (к примеру, кодирующие CDR участки мышиных антител, полученных гибридомной технологией). Проводят раздельную ПЦР-амплификацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи. Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей. кДНК, кодирующие, сответственно Н- и L-цепи Fv-фрагмента встраивают в вектор, в геном бактериофага.[13]

Затем среди рекомбинантных бактериофагов, in vitro отбираются те, которые в большем количестве экспрессируют белок CDR, способный связываться со специфическим антигеном.Впервые возможность экспрессии одноцепочечных последовательностей, составленных из вариабельных доменов антител в составе гибридного белка оболочки нитевидного фага, была продемонстрирована еще в 1990-х годах. Рекомбинантные антитела экспонируются на поверхности репродуцировавшихся модифицированных нитевидных бактериофагов (каждый фаг несет один вариант антител). Далее эти антитела, гены которых закодированы в ДНК бактериофага-вектора, отбираются in vitro по способности взаимодействовать с антигеном.

Таким образом создание рекомбинантных антител нужной специфичности начинается с получения библиотеки клонов ДНК, встроенных в соответствующее число бактериофагов. Затем проводится биопаннинг (biopanning) - селекция бактериофагов, обладающих большей аффинностью к иммобилизованным лигандам (специфическим антигенам). Биопаннингом или аффинной селекцией можно существенно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать фаги, несущие гены, кодирующие синтез мини-антителс нужными свойствами. Число клонов ДНК в составе одной фаговой библиотеки, созданной технологией фагового дисплея способно кодировать синтез разной специфичности антител, соизмеримых с их разнообразием в организме млекопитающего.[19]

Метод фагового дисплея, относящийся к технологии рекомбинантной ДНК в отличие от гибридомной технологии позволяет существенно повышать аффинность синтезируемых антител (оптимизировать сайты связывания с антигеном). Дополняя биопаннинг повторением циклов отбора бактериофагов с использованием мидификации генов (использование ошибающейся полимеразы или ПЦР-мутагенез, либо применяя направленный ПЦР-мутагенез гипервариабельных петель антител) можно еще более повысить аффинность и создать более эффективно связывающиеся антитела.

Например, с помощью фагового дисплея получены антитела к аутоантигену - фактору некроза опухоли альфа (применяются эти антитела как антиревматоидное средство), к тканевому фактору роста бета (для терапии фиброзных болезней в офтальмологии), к опухолевому антигену и т.д. С целью продукции рекомбинантных антител, модифицированную кДНК встраивают в векторы экспрессии и трансформируют ими подходящие клетки-хозяева (микроорганизмы,чаще E.coli или клетки млекопитающих).[12]

Для синтеза полноразмерных рекомбинантных антител векторы экспрессируют в клетках млекопитающих. Только в эукариотических клетках возможна правильная сборка белковой молекулы и гликозилирование, необходимое для выполнения антителами эффекторных функций. Так, в лимфоидных клетках экспрессия химерных антител находится под контролем естественной системы регуляции - промоторы, энхансеры, факторы транскрипции.Подобные системы регуляции в прокариотных клетках отсутствуют. Полученный в результате отбора клон лимфоцитов, продуцирующий рекомбинантные антитела культивируется в биоректоре.

В современных технологиях используются биореакторы с полыми волокнами, стенки которых образованы полупроницаемыми мембранами. По волокнам циркулирует культуральная среда, компоненты которой проникают через полупроницаемые мембраны в основной отсек, где находятся культивируемые клетки, в нем собираются синтезируемые антитела, они не проникают через полупроницаемую мембрану. Важным преимуществом данного метода культивирования является сравнительно высокая концентрация конечного продукта - антител Собранная культуральная среда, содержащая продуцированные клетками антитела, подвергается очистке аффинной, ионообменной и гельпроникающей хроматографией, чтобы получить высокоочищенные белки - антитела.[3]

ГЛАВА 3

Date: 2016-08-30; view: 524; Нарушение авторских прав