Культивирование гибридом in vitro и in vivo

in vitro. Когда клетки становятся достаточно многочисленными, их переносят в лунки объемом 1-2 мл. Для этого за 2 дня до переноса гибридом в планшеты для культивирования (например, Linbro с 24 лунками) вносят ядросодержащие сингенные клетки селезенки (по 5х105 клеток в лунку). Гибридомы аккуратно суспендируют при помощи движений поршня пипетки и переносят по 100 мкл из каждой исходной лунки в 2 лунки объемом 1 мл. Начиная с 5-й недели после слияния, трижды производят замену среды (ГТ, а не ГАТ). В дальнейшем можно вести культивацию в обычной культуральной среде. [7]

В лунках объемом 2 мл гибридомы так разрастаются, что их переносят в планшеты с четырьмя лунками по 5 мл. Стабильные гибридомы можно переносить в культуральные сосуды по 25-50 мл. На этой стадии можно заменять сыворотку плода коровы нормальной сывороткой коров или лошадей. В этих сосудах среду следует также менять каждые 3-4 дня. На этом этапе можно получить достаточное количество клеток для культивирования in vivo на сингенных мышах.

Отбираемые при смене среды моноклональные антитела можно использовать для характеристики специфичности и молекулярных особенностей иммуноглобулин. В среднем концентрация моноклональных антител в культуральной среде составляет 10-50 мкг/мл.[11]

in vivo. Сингенным мышам предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл полужидкого парафина (DAB 7, VEB Leunawerke, Merseburg) или пристана (Koch-Light Lobs). Через 1-4 недели после предварительной обработки внутрибрюшинно вводят по 2х107 гибридных клеток каждому животному. В асцитической жидкости мышей концентрация моноклональных антител может достигать 5-10 мг/мл. Содержащиеся в асцитической жидкости гибридомы можно перевивать другим мышам после предварительной обработки.

Date: 2016-08-30; view: 539; Нарушение авторских прав