Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Гибридомная технологияК сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимого типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью. [6] В действительности продуцировать антитела способны только единичные гибридомные клетки. Их необходимо выделять и размножать клонированием. После тестирования клонов на способность образовывать антитела отбирают положительные культуры, которые снова клонируют и подвергают последующей селекции. В результате получают гибридому, продуцирующую моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши. Таким способом получают моноклональные антитела к определенным антигенам бактерий иливирусов, опухолевых клеток, лимфоцитов, а также к гормонам, ферментам, медиаторам и т. д.[9] За несколько лет проблема изучения и практического использования гибридом проделала взрываподобное развитие. Сотни исследователей в различных странах подключились к ее разработке. Конечно, получение лимфоцитарных гибридом дело не простое. Оно включает в себя несколько этапов: 1. Получение миеломной линии; 2. Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма; 3. Создание в ультуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние; 4. Выделение слившихся клеток и накопление их клонов; 5. Отбор интересующего клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляют in vitro или путем введения животным. При этом на всех этапах образцы клеток необходимо консервировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны. [14] Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить монАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки, лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).[7] Ключевая идея, лежащая в основе получения mAb(1975 г.), как и всё гениальное, очень проста: сделать бессмертным В-лимфоцит, который исходно синтезирует антитела одного вида и специфичности, но сам по себе может совершать в культуре лишь ограниченное число делений в течение 10-14 дней культивирования. Практически это достигается путем слияния первичных В-лимфоцитов, секретирующих антитела, с опухолевыми миеломными клетками, которые данной способностью не обладают, но могут неограниченно долго делиться в культуре. В результате образуются гибридные клетки (гибридомы), которые приобретают от одной из исходных клеток способность продуцировать антитела требуемой специфичности, а от другой - способность к продолжительному росту и делению в культуре. Реализация данной схемы начинается с иммунизации экспериментальных животных, как правило мышей, антигенами, против которых предполагается получать антитела. Иммуногенами могут быть препараты очищенных макромолекул, их различные смеси, а также целые клетки или субклеточные структуры. После достижения антителами в сыворотке крови мышей необходимого титра селезенку иммунизированных животных используют в качестве источника В-клеток, продуцирующих искомые антитела. Для создания перевиваемых линий клеток свежевыделенные лимфоциты селезенки сливают в присутствии фьюзогена (полиэтиленгликоля) с опухолевыми (плазмацитомными или миеломными) лимфоцитами животного в идеале того же вида, которые могут делиться неограниченно долго. Такие иммортализованные клетки должны обладать развитым эндоплазматическим ретикулумом и не синтезировать иммуноглобулины, кодируемые их собственными генами. Кроме того, эти клетки должны обладать чувствительностью к селектирующему агенту (аминоптерину или азасерину). Гибридные клетки (гибридомы) отделяют от исходных опухолевых клеток на селективной питательной среде HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine), содержащей указанные соединения, включая ингибитор биосинтеза нуклеотидов аминоптерин, в которой исходные миеломные клетки не могут делиться и погибают. Это происходит потому, что миеломные клетки не содержат одного из ферментов: гипоксантин-фосфо-рибозилтрансферазы (HPRT) или тимидинкиназы (ТК), необходимых для роста клеток на селективной среде. [14] Гены данных ферментов клетки получают в результате слияния от В-лимфоцитов селезенки. Сами же клетки селезенки сохраняют свою жизнеспособность в культуре в течение 10-14 дней, после чего спонтанно погибают. Суспензию гибридных клеток распределяют по лункам 96-луночных плашек, содержащих в виде монослоя питающие клетки, которые обеспечивают гибридомы факторами роста, необходимыми для их эффективного размножения. В современном варианте культивирования питающие клетки могут быть заменены полноценными питательными средами. Выращенные таким образом в небольшом количестве культуры гибридных клеток проверяют на способность секретировать в питательную среду специфических антител и далее рассевают до отдельных клеток методом последовательных разведений. В результате, каждая клетка потенциально может стать родоначальницей клона, продуцирующего mAb требуемой специфичности.[16] Поскольку синтез антител в ряде случаев может быть токсичным для клетки-продуцента, вместо культивирования in vitro на этой стадии параллельно используют культивирование in vivo в виде асцитных опухолей у мышей. Отмечено, что непродолжительное культивирование in vivo в дальнейшем способствует стабилизации клеточных линий, продуцирующих mAb. Полученные таким образом, охарактеризованные клоны гибридом являются источником неограниченного количества mAb данной специфичности, которые можно получать, культивируя гибридомы в искусственной питательной среде или асцитной жидкости организма мышей. [3]
|