Определение чувствительности к иммуномодуляторам

До клинического применения иммуномодуляторов предварительная оценка индивидуальной чувствительности организма к ним оказывается существенно эффективной. Действие иммуномодуляторов определяется особенностями иммунной системы, в частности взаимосвязанным и взаимозависимым функционированием клеточных элементов, участвующих в развитии иммунного ответа.

Крайне важным подходом к назначению иммунокорректоров является предварительное вычленение основного пораженного звена иммунитета и адресная доставка иммуномодуляторов, ибо в противном случае применение иммуномодулирующих средств может быть неэффективным.

Разработка новых подходов к оценке иммуномодулирующей эффективности новых препаратов положительным образом сказывается на развитии клинической иммунологии и создании новых методов определения состояния иммунной системы человека и показаний для назначения иммуномодулирующих средств и контроля за проводимой терапией.

Глава 4. Гибридомная технология. Получение и использование моноклональных антител

Термины

АОК — антителообразующая клетка; плазматическая клетка; зрелый В-лимфоцит.

ГАТ — питательная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин.

ГГФРТ — фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза. Катализирует синтез нуклеотидов.

ДМЕМ — питательная среда Игла специальная.

ДМСО — диметилсульфоксид. Стабилизатор.

ПЭГ — полиэтиленгликоль.

Фидер — вспомогательная культура клеток, выполняющая функции по детоксикации среды и подкормки основной культуры клеток.

ФСТ — фетальная сыворотка теленка.

Гибридомную технологию с полным правом можно назвать методом иммунобиотехнологии с очень широким диапазоном применения: от диагностики и лечения заболеваний разной этиологии до судебной экспертизы. В ветеринарной практике данный метод с успехом применяется для получения моноклональных антител, уникальная структура которых как раз позволяет проводить точную специфическую диагностику болезней, вызванных инфекционными агентами.

В представленном методическом пособии изложен общий иммунобиотехнологический принцип получения гибридом, способных секретировать специфические антитела заданной направленности.

При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) — в крови появляются защитные белки — антитела, для которых характерна необыкновенная, уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6–8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка. В одном белке, состоящем из нескольких сот аминокислот, имеется несколько (от 5 до 15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания с ней. То же относится и к поли-сахаридным антигенам, детерминантные группы которых образуются 3–6 остатками моносахаридов.

Таким образом, при введении антигена возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает их абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.

Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Но получить такие антитела путем иммунизации невозможно по причине образования большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Дело в том, что в организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество генетически однородных семейств клеток-клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител. Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам (в этом, кстати, суть клонально-селекционной теории Бернета).

Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны АОК в пробирке — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, т.е. антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования АОК.Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.

Гибридомы

В 1975 г. иммунологи Георг Келер и Цезарь Мильштейн разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это имудалось осуществить.

Методы гибридизации соматических (т.е. не половых) клеток к тому времени были хорошо известны ишироко применялись для разных целей. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двухъядерные гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. Таким образом возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридома. Гибридому можно получить имежду нормальной АОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой.Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки. Весь ее синтетический аппарат был настроен на синтез иммуноглобулинов. Проблема заключалась в том, как отделить образовавшуюся гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые.

Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего, был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которой можнобыло контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеется два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов, звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот. Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем — способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот; гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.

Синтез нуклеотидов по второму пути может происходить лишь в том случае, когда в клетке присутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ). Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, Т и А (ГАТ-среда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были не способны усваивать Г и Т, т.е. были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, т.е. гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток.

Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у мышей брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК) и готовили из них взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в ГАТ-среду. Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре. Плазмоцитомные клетки и их гибриды тоже погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной клетки. Такие гибриды — гибридомы — сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела. Техника их получения была названа гибридомной технологией (рис. 16).

Рис. 16. Схема получения моноклональных антител

Date: 2016-05-13; view: 693; Нарушение авторских прав