Продукция IgG В-клетками in vitro

Продукцию IgG клетками селезенки и костного мозга, спонтанную и LPS-стимулированную, определяют в супернатантах клеточных культур после культивирования в течение 7 дней. Оптимальная доза LPS E. coli, установленная в предварительных опытах, составляет 30 мкг/мл. Результаты выражают в мкг/мл и индексах стимуляции (IS — отношение разницы между опытом и контролем к контролю).

Концентрацию IgG в периферической крови и супернатантах культур определяют твердофазным вариантом метода иммуноферментного анализа в 96-луночных плоскодонных планшетах фирмы E.I.A. «Linbro» с помощью меченного пероксидазой хрена конъюгата и ОФД в качестве субстрата. В качестве основного буфера используется Tris-NaCl, блокирующего агента — желатин.

Также предварительно должны быть определены оптимальные разведения конъюгатов и антисывороток. Интенсивность реакции оценивают на многоканальном спектрофотометре Multiskan при l = 492 нм. Калибровочную кривую строят по препаратам IgG (Sigma) (10–100 нг/мл). Результаты выражают в абсолютных значениях (мг/мл, мкг/мл).

Оценка клеточного звена иммунной системы

Т-лимфоциты — самая многочисленная (60 %) популяция клеток иммунной системы (ИС), которая в свою очередь разделяется на субпопуляции. Хелперы и супрессоры являются иммунорегуляторными клетками, а киллеры и эффекторы ГЗТ — эффекторными (рис. 15).

Рис. 15. Взаимодействие Т-лимфоцитов

Т-киллеры разрушают инфицированные клетки и клетки опухолей. Существует еще субпопуляция так называемых естественных киллеров (ЕК), они имеют CD56/57+. Это большие гранулярные клетки, в гранулах содержится белок перфорин, который может проникать в мембрану клетки-мишени и в результате полимеризации образовывать мембраноатакующий комплекс (своеобразная «дырка» в мембране), вызывая осмотический «взрыв» и лизис клетки.

Клеточный иммунный ответ разделяют на стадии:

• распознавание антигена макрофагом или другой антиген-презентирующей клеткой;

• обработка антигена макрофагом или другой антиген-презентирующей клеткой;

• презентация обработанного антигена в комплексе с белками МНС I и МНС II (Т-киллеры непосредственно взаимодействуют с комплексом АГ* МНС I, а Т-эффекторы — посредством Т-хелперов);

• передача информации на Т-хелперы;

• передача информации на Т-эффекторы;

• пролиферация и дифференцировка Т-эффекторной популяции под действием интерлейкина.

Т-киллеры при встрече с чужеродной клеткой выделяют перфорин, разрушающий ее мембрану. Т-эффекторы оказывают опосредованное действие: выделяют факторы хемотаксиса, подавления миграции макрофагов и лейкоцитов, активации. Клетки в очаге пролиферации образуют инфильтрат, который окружается фибробластами, продуцируемым ими коллагеном, и становится гранулемой. Гранулема выполняет ограничивающую функцию — локализует процесс воспаления, препятствует его распространению; элиминирующая функция выражена слабо.

Т-клеточные ответы заканчиваются формированием двух субпопуляций эффекторных Т-клеток:

1) цитотоксических Т-лимфоцитов (или Т-киллеров);

2) эффекторных Т-лимфоцитов воспаления.

Оценка клеточного звена иммунной системы включает определение количества (по CD маркерам) различных субпопуляций Т-клеток (CD3,CD4 и др.) с помощью моноклональных антител и изучение их функциональных свойств (пролиферация в ответ на митогены, аллоантигены и др.). Оценка проводится как in vivo, так и in vitro.