Рост и субкультивирование гибридом

Гибридные клетки, растущие в ГАТ, через 7–12 дней формируют в лунках микроскопически различимые колонии. Количество их в планшетах может быть различным, что зависит от посадочной концентрации клеток, эффективности гибридизации.

Первые 5–7 дней среду в планшетах не меняют. В дальнейшем 2-3 раза в неделю производят замену 1/2–1/3 части культуральной среды на свежую ГАТ-среду с 20 % ФСТ. Большинство колоний гибридных клеток хорошо растут, активно истощают среду и требуют более частой ее смены, чем плохо растущие колонии. Культуры с плохим ростом требуют более осторожного обращения, беспокоить их необходимо как можно меньше и добавлять только 2-3 капли свежей среды в неделю.

Скрининг. На 14–21-й день, когда большинство колоний начнут активно расти (о чем судят по быстрому закислению среды культивирования), необходимо проводить тестирование гибридомных супернатантов на присутствие антител. Общепринятым методом скринирования гибридомных культур на специфическую активность является непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Метод лишен многих недостатков, характерных для тестов вирусной нейтрализации, иммунодиффузии, РСК, РЗГА, ИМФА и др., поскольку основан на обнаружении просто специфического взаимодействия антител с антигеном, а не на выявлении последующего взаимодействия. Так как некоторые гибридомы продуцируют низкие титры антител при культивировании в среде с пониженным содержанием сыворотки, необходимо первые две недели использовать среду, содержащую 20 % ФСТ.

После тестирования отмечают те лунки пластин, культуральная среда в которых содержала антитела к антигенам вируса. Большинство положительно реагирующих лунок будут содержать гибридные клетки. Присутствие антител в культуральной жидкости небольшой части прореагировавших лунок, не содержащих гибридных клонов, объясняется наличием в них фрагментов селезенки, в которых антителопродуцирующие спленоциты некоторое время сохраняют свою жизнеспособность, поэтому через 5–6 дней проводят повторное тестирование. Обычно за это время спленоциты погибают и положительная реакция отмечается лишь в лунках с антителопродуцирующими гибридами.

После тестирования проводят субкультивирование клонов из положительно прореагировавших лунок. Для субкультивирования используют 96-луночные культуральные планшеты с 1–2-дневными культурами перитонеальных макрофагов. В каждую лунку переносят по одному клону из положительных лунок исходных планшет. Через 3–5 дней культивирования пересаженных клонов их жизнеспособность проверяют в инвертированном микроскопе и вновь тестируют гибридомные супернатанты на присутствие антител. Так как неклонированные гибридомы часто теряют способность продуцировать антитела, их необходимо как можно раньше клонировать.

После клонирования гибридомы наращивают для замораживания, а также для получения содержащей моноклональные антитела культуральной жидкости. Для этого клоны с наиболее интенсивной продукцией выращиваются в лунках 96-луночной планшетах до образования почти сплошного монослоя, после чего каждый клон переносится в отдельную лунку 24-луночной пластины с фидерными клетками. К этому времени среду ГАТ заменяют на ГТ, не содержащей аминоптерина. Через 2-3 дня, когда эти культуры подрастут и покроют около 70% поверхности роста, их делят в две другие группы и т.д., наращивая каждый клон до необходимого количества клеток. Культуры гибридом, находящиеся в стадии логарифмического роста, криоконсервируют. Часть клеток, оставшихся после криоконсервации клонов, вновь интенсивно выращивают в ГС, содержащей 20 % ФСТ, до образования сплошного монослоя. Для получения моноклональных антител с целью предварительного исследования их характеристик среду в лунках не меняют 4–5 дней. Когда среда пожелтеет, но клетки еще сохраняют жизнеспособность, ее отбирают, центрифугируют и хранят в стерильных флаконах при –4 °C. При необходимости культуральную жидкость замораживают и хранят при –70 °C.

Для получения моноклональных антител в высоких концентрациях гибридомы вводят в брюшную полость обработанных пристаном мышам линии BALB/c с целью индукции асцитных опухолей.

Если в контрольной ампуле криоконсервированных после восстановления 70–90 % клеток останутся жизнеспособными и не утратят способности секретировать антитела, дальнейшее культивирование гибридомной культуры прекращают.