Определение количества субпопуляций Т-лимфоцитов

Принцип метода: моноклональные антитела (мАТ) к поверхностным дифференцировочным антигенам лимфоцитов периферической крови используют для определения их фенотипа и количественного учета. Количество лимфоцитов определенного фенотипа существенно изменяется при вирусных заболеваниях и аутоиммунных патологиях, стрессе. Определение фенотипа лимфоцитов рекомендуется проводить при использования иммуномодуляторов, при наличии клинических признаков иммунологической недостаточности. Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов осуществляется на проточных цитометрах после их специфического связывания с мАТ и окрашивания антиглобулиновыми антителами, меченными флуорохромом или на люминесцентном микроскопе. В настоящее время существует большое количество типов антител к дифференцировочным антигенам лимфоцитов животных. Классификация мАТ базируется на группах мАТ, реагирующих с одними и теми же дифференцировочными антигенами на лимфоцитах человека (CD — cluster of differentiation; CD-номенклатура).

Циркулирующие иммунные комплексы

В последние годы большое диагностическое значение придают определению в сыворотке крови циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Они представляют собой растворимые комплексы антиген-антитело, которые в норме фагоцитируются макрофагами и разрушаются. Для определения ЦИК используют метод осаждения (преципитации) ЦИК раствором полиэтиленгликоля. После инкубации и центрифугирования выпавшие в осадок ЦИК растворяют раствором едкого натра и определяют их содержание в растворе на спектрофотометре, выражая количество иммунных комплексов в единицах оптической плотности. Определение ЦИК в сыворотке крови возможно также с помощью метода иммунофлуоресценции. Увеличение концентрации ЦИК может иметь два важных в практическом отношении следствия.

Во-первых, ЦИК могут приводить к повреждению мембран и способствовать развитию иммунопатологического процесса в органах. Особенно часто это наблюдается при снижении функциональной активности тканевых макрофагов.

Во-вторых, ЦИК обладают способностью активировать систему комплемента, хемотаксическим действием по отношению к лимфоцитам и нейтрофилам, активируют систему свертывания крови, кининовую систему, выделение гранулоцитами и макрофагами биологически активных веществ и т.д. Эти эффекты ЦИК сопровождаются развитием воспаления тканей. Повышение концентрации ЦИК обнаруживают при многих заболеваниях, в основе которых лежат нарушения клеточного иммунитета, в первую очередь при различных аутоиммунных заболеваниях.

Определения фенотипа и количества лимфоцитов с помощью моноклональных антител на лазерном проточном цитометре методом непрямой иммунофлуоресценции

Немеченые мышиные моноклональные антитела (мАТ) к соответствующим поверхностным рецепторам разных популяций лимфоцитов крови человека (животных) после их прикрепления визуализируются добавлением антимышиных иммуноглобулинов, меченных флуоресцентными красителями (например ФИТЦ или фикоэритрином).

Необходимое оборудование:

• мАТ нужной специфичности.

• Лейкоцитарная клеточная взвесь или мононуклеарные клетки крови, выделенные из 3 мл крови.

• Среда 199.

• 1%-ный параформальдегид.

• Фиколл-верографин.

• 70%-ный глицерин.

• Проточный цитофлуориметр.

• Центрифуга на 3000 об/мин.

• Термостат 37 °C.

• Холодильник бытовой (+4 °C).

• Полная рабочая среда (ПРС).

• Лизирующий раствор.

Постановка метода:

1. Производится забор крови из вены в объеме 3 мл с гепарином (из расчета 15–20 единиц на 1 мл крови).

2. Наслаивают на 0,5 мл раствора фиколл-верографина (плотностью 1,077 г/см³) и центрифугируют при 400g 25 мин.

3. Пастеровской пипеткой отбирают лейкоцитарное кольцо и дважды отмывают центрифугированием (200g, 10 мин) в среде 199.

4. Осадок ресуспендируют в среде 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в объеме 1 мл.

5. С помощью камеры Горяева определяют число ядросодержащих клеток и доводят их концентрацию до 2·10⁶ клеток/мл средой 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой.

6. К осадку клеток добавляют 0,5 мл ПРС, клеточную взвесь разливают по 50 мкл в лунки 96-луночных круглодонных планшетов.

7. В каждую лунку вносят по 50 мкл предварительно разведенных мАТ: первая лунка — контроль (добавляют ПРС), 2-я, 3-я, 4-я, 5-я лунки — мАТ CD3, CD4, CD8, CD21 соответственно.

8. Планшет ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).

9. Клетки дважды отмывают от мАТ путем добавления в каждую лунку по 200 мкл ПРС и центрифугирования планшетов в течение 5 мин при 1000 об/мин.

10. В случае если мАТ не соединены с флуорохромом, проводят процедуру докрашивания, добавляя в каждую лунку по 50 мкл антимышиных иммуноглобулинов, меченых ФИТЦ в соответствующем инструкции разведении.

11. Планшеты ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).

12. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл ПРС и затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин (300g). Надосадочную жидкость из планшета стряхивают резким движением.

13. Лизируют оставшиеся в пробе эритроциты: к осадку добав­ляют по 200 мкл лизирующего раствора.

14. Встряхивают на шейкере 1 мин, сразу центрифугируют 5 мин при 300g, надосадочную жидкость выливают резким движением.

15. Быстро добавляют ПРС до полного объема лунки, центрифугируют при тех же условиях и сливают надосадочную жидкость.

16. Для фиксации к осадку добавляют по 100 мкл 2%-ного параформальдегида и ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).

17. Добавляют ПРС до полного объема лунки.

Для длительного хранения препаратов слегка увлажняют прокладку из фильтровальной бумаги, закрывают планшет этой бумагой и сверху накрывают крышкой. Планшет помещают в холодильник и затем просчитывают образцы на цитометре.