Главная Случайная страница


Полезное:

Как сделать разговор полезным и приятным Как сделать объемную звезду своими руками Как сделать то, что делать не хочется? Как сделать погремушку Как сделать неотразимый комплимент Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами Как сделать идею коммерческой Как сделать хорошую растяжку ног? Как сделать наш разум здоровым? Как сделать, чтобы люди обманывали меньше Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили? Как сделать лучше себе и другим людям Как сделать свидание интересным?

Категории:

АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника






Метаболитическая перегрузка





 

Как мы уже отмечали введение в клетку чужеродной ДНК, и ее экспрессия часто приводят к различным нарушениям клеточного метаболизма. Это явление носит название метаболитическая перегрузка и может возникать по разным причинам:

1.Увеличение затрат энергии (АТФ) и метаболитов на экспрессию, как клонированного гена так и генов самого вектора, и возможность их истощения.

2. Нехватка кислорода и невозможность обеспечения им всех метаболити-ческих реакций, как нужных для клетки, так и для экспрессии клонируемого гена.

3. Нарушение внутриклеточной локализации и экспорта жизненно важных клеточных белков, вследствие перепроизводства чужеродного белка

Это может привести к таким нежелательным явлениям как снижение скорости роста трансформированных клеток, потере ими рекомбинантных плазмид или удалению рекомбинантного гена из плазмиды.

Поскольку клеткам, растущим в условиях мета­болической перегрузки, не хватает энергии для нормального функционирования, нарушения затрагивают прежде всего такие энергоемкие метаболические процессы, как фиксация азота или синтез белков. Могут изменяться также размер и форма клеток, образовываться слишком много внеклеточного полисахарида, склеивающего клетки друг с дру­гом и затрудняющего микрофильтрацию.

Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного ко­личества чужеродного белка и нехваткой пита­тельных веществ или «строительных блоков» - аминокислот, может произойти запуск стрессо­вых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеаз, под действием ко­торых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка.

Многократно возрастает вероятность трансляционных ошибок. Так для Е. Coli в нормальных условияхонасоставляет 2•10-4 - 2•10-3 % на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки опреде­ленных аминоацил-тРНК или гуанизинтрифосфата, что часто случается при суперпродукции чужеродных белков, веро­ятность включения в белковую молекулу непра­вильной амино-кислоты, вместо недостающей сильно увеличивается (в десятки и сотни раз).



Это не позволяет использовать синтезируемый белок в качестве лекарствен-ного средства, поскольку:

1) удельная активность и стабильность белка могут быть гораздо ниже ожидаемых;

2) наличие в молекуле «неправиль­ных» аминокислот может вызвать нежелатель­ную иммунологическую реакцию при введении такого белка в организм человека.

Для снижения влияния метаболитической перегрузки используют следующие подходы или их комбинацию:

1.Использование малокопийных плазмидных векторов.

2.Отказ от использования векторов и встраивание клонируемого вектора в хромосомную ДНК организма-хозяина.

3. Использование регулируемых промоторов.

 

4. На практике эффективным спосо­бом увеличения количества чужеродного белка, синтезируемого рекомбинантным микроорганиз­мом, состоит в поддержании уровня экспрессии его гена на среднем уровне (так, чтобы на долю продукта приходилось примерно 5% суммарного клеточного белка), но при максимальной плотности клеточной культуры, что достигается подбором соответствующих условий (аэрирование, перемешивание, термостатирование). Так микробиологиче­ская система с 5%-ным уровнем экспрессии чу­жеродного белка и низкой метаболической нагрузкой, в которой плотность может достигать 40 г/л (масса сухого вещества), оказывается более эффективной, чем система с 15%-ым уровнем экспрессии и плотностью 10 г/л.

 






Date: 2016-02-19; view: 196; Нарушение авторских прав

mydocx.ru - 2015-2019 year. (0.007 sec.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав - Пожаловаться на публикацию