Повышение эффективности секреции

Стабильность белков, кодируемых клонирован­ными генами, значительно зависит от их клеточной локали­зации. Например, рекомбинантный проинсулин оказывается примерно в 10 раз более стабиль­ным, если он секретируется (экспортируется) в периплазму (пространство между плазматиче­ской и наружной мембранами у грамотрицательных бактерий), а не остается в цитоплазме. Кроме того, белки, секретируемые в периплазму или в среду, легче очистить.

Обычно транспорт белков через клеточную мембрану обеспечивают специфические N-концевые аминокис­лотные последовательности, называемые сиг­нальными пептидами (сигнальными последова­тельностями, лидерными пептидами). Иногда удается сделать белок секретируемым, присое­динив к кодирующему его гену нуклеотидную последовательность, ответственную за синтез сигнального пептида. Однако простое наличие сигнального пептида не обеспечивает эффек­тивной секреции. Кроме того, Е. coli и другие грамотрицательные микроорганизмы обычно не могут секретировать белки в окружающую среду из-за наличия наружной мембраны. Есть, по крайней мере, два способа решения этой пробле­мы. Первый - использование грамположительных бактерий, у которых нет наружной мембраны, второй - создание с помощью генной инженерии грамотрицательных бактерий, способных секретировать белки в культуральную среду.

Если слияние гена-мишени с фрагментом ДНК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких прие­мов, с успехом примененных в отношении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодиру­ющим полноразмерный предшест-венник мальтозосвязывающего белка, а не только его сиг­нальную последова-тельность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Х_а. Когда такой химер­ный ген включили в плазмидный вектор и ис­пользовали его для трансформации Е. coli, в пе­риплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обрабо­тав его фактором Х_а, получили функциональ­ный интерлейкин-2.

По данным одной из работ, секреция многих рекомбинантных белков в Е.coli зависит от уровня экспрессии соответствующих генов. Чужеродные белки, синтезируемые наиболее активно, не обя­зательно столь же активно секретируются. Иног­да интенсивный синтез чужеродного белка вызы­вает перегрузку секреторного аппарата и его блокирование. Таким образом, если нужно, что­бы данный белок хорошо секретировался, то не обязательно стремиться поддерживать максимальным уровень экспрессии соответствующего ему гена.

Некоторые грамотрицательные бактерии секретируют в среду белок, называемый бактериоцином. Он активирует фосфолипазу А, локализо­ванную во внутренней мембране бактериальной клетки, в результате чего и внутренняя, и наруж­ная мембраны становятся проницаемыми, и не­которые цито- и периплаз-матические белки вы­свобождаются в культуралъную среду. Таким образом, можно встроить ген бактериоцина в плазмиду так, чтобы он находился под контролем сильного регулируемого промотора, трансфор­мировать клетки Е. coli этой плазмидой и сде­лать их проницаемыми. Если же Е. coli уже несут ген бактериоцина, их можно трансформировать другой плазмидой, которая содержит ген нужно­го белка, сшитый с нуклеотидной последова­тельностью, кодирующей сигнальный пептид. Если оба гена находятся под контролем одного промотора, то их можно индуцировать одновременно, и белок клонированного гена будет сек-ретироваться в среду.

Грибы Aspergillu s секретируют в среду большое количество ферментов и широко используются для их промышленного производства. В одной из работ осуществили слияние гена человеческого интерферона с геном сигнального пептида, ответ­ственного за секрецию, и поместили эту конструк­цию под контроль глюкоамилазного промотора Aspergillus nidulans, индуцируемого крахмалом. После добавления последнего в среду с трансфор­мированными клетками Aspergillus nidulans выход секретируемого человеческого интерферона дос­тиг 1 мг на 1 л, что эквивалентно примерно 5% всего секретируемого клеточного белка. Эта рабо­та показывает, что стратегии модулирования ген­ной экспрессии, разработанные для Е. coli, можно использовать и применительно к другим биологи­ческим системам.

Date: 2016-02-19; view: 522; Нарушение авторских прав