Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Выделение и идентификация коринебактерииКультивирование. Коринебактерии — факультативные анаэробы, температурный оптимум 37-38° С, рН питательных сред 7,4-7,6. Для выделения патогенных коринебактерии используют кровяной, сывороточный (5%) МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, кровяную теллуритовую среду, среду Леффлера. Контаминированный материал для подавления роста грамотрицательных бактерий засевают на агар Мак-Конки. Посевы инкубируют в условиях обычной атмосферы 24-48 часов. Особенности роста коринебактерии на питательных средах. С.pseudotuberculosis на кровяном агаре через сутки инкубирования формирует желто-белые или белые с матовой поверхностью, непрозрачные колонии диаметром около 1 мм. Через 48-72 часа культивирования проявляется узкая зона гемолиза (у большинства штаммов). При длительном инкубировании размер колоний может достигать 3 мм, они приобретают коричневатый цвет и крошковидный характер. На среде Леффлера возбудитель растет в виде крошковатого с желтым оттенком налета, без разжижения сыворотки. На кровяной теллуритовой среде колонии мелкие, слабовыпуклые, с матовой поверхностью, черного цвета. В питательном бульоне возбудитель растет без или с равномерным помутнением среды, с появлением небольшой пленки и осадка. C.renale через 24 часа инкубирования образует мелкие, негемолитические колонии, с возрастом превращающиеся в непрозрачные, белые. C.pilosum образует колонии, сходные с колониями C.renale, приобретающие с возрастом цвет от желтого до коричневого. C.cystitidis формирует колонии как и C.renale, но обычно белого цвета. C.equi (R.equi) через 24 часа выращивания посевов образует мелкие, гладкие, блестящие колонии, негемолитические. В более старых культурах колонии желтовато-розового цвета. Морфология клеток коринебактерии в культуре. Из подозрительных колоний готовят и микроскопируют мазки, окрашенные по Граму. Клетки коринебактерии в мазках из колоний по морфологии и тинкториальным свойствам в основном не отличаются от таковых в препаратах из исходного материала. Идентификация коринебактерии на уровне рода. Культуры бактерий, сходные по морфологическим, тинкториальным, культуральным свойствам с коринебактериями, отвивают на питательные среды и исследуют с целью идентификации. Для идентификации на родовом уровне принимают во внимание происхождение материала, тинктори-альные особенности (быстрота обесцвечивания при окраске по Граму), морфологию клеток, отношение к кислороду, подвижность, каталазную активность. Идентификация коринебактерии на уровне вида. Выделенные культуры на последующем этапе дифференцируют на виды путем изучения гемолитической активности на кровяном агаре, ферментативных свойств: гидролиз эскулина, редукция нитратов, разжижение желатины, образование уреазы, образование кислоты без газа из глюкозы, мальтозы, сахарозы (табл. 61). С целью дифференциации коринебактерии «ренальной» группы дополнительно изучают скорость формирования колоний, цвет, рост при рН 5,4 (в бульоне), редукцию нитратов, разжижение желатина, гидролиз твина-80, образование кислоты из ксилозы, крахмала (табл. 62). С целью уточнения видовой принадлежности выделенной культуры коринебактерии число изучаемых признаков может быть в случае необходимости расширено (табл. 63). Биопроба. При заражении мышей культурами С. pseudotuberculosis выявляется вариабельность их вирулентности. При внутривенном заражении погибает 90,7% животных, при подкожном — около 21,2%. В результате внутрибрюшинного заражения морских свинок (самцы) можно вызвать орхит.
Питательные среды. Среда Тинсдаля. К 1000 мл расплавленного и охлажденного до 50° С 2%-ного МПА добавляют 120 мл 1%-ного раствора L-цистина на 0,1 N хлористоводородной кислоте, 120 мл 0,1 N раствора гидроокиси натрия, 18 мл 2%-ного раствора теллурита калия, 18 мл 2,5%-ного раствора гипосульфата натрия и 200 мл стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Приготовление раствора теллурита калия. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г теллурита калия. Раствор стерилизуют в кипящей водяной бане 30 минут и хранят при комнатной температуре. В случае выпадения осадка раствор вновь прогревают в водяной бане.
Таблица 61 - Дифференциальные признаки грамположительных,
Таблица 62 - Дифференциация коринебактерий и Rhodococcus equi
+ положительная реакция; - отрицательная реакция; v - варьирующий признак; v"- штаммы, выделенные от лошадей позитивные, от овец - негативные.
Таблица 63 - Дифференциация С. renale, C. pilosum, C. cystitidis
Таблица 64 - Дифференциальные признаки видов коринебактерий
' Исключение — тип ulcerans; 2 около 50% штаммов положительны; 3 тип ulcerans может быть отрицательным; 4 некоторые штаммы отрицательные; 5 некоторые штаммы положительные; нд — нет данных; х — 11-89% штаммов положительные.
Приготовление раствора гипосульфита натрия. Раствор готовят на стерильной дистиллированной воде. После добавления каждого компонента среду тщательно перемешивают и, не стерилизуя, разливают по чашкам Петри. До использования среду можно хранить при 10° С не более 3-4 суток. Среда предназначена для дифференциации возбудителя дифтерии и дифтероидов. Коринебактерии дифтерии образуют колонии черного цвета, т.к. способны продуцировать сероводород из цистина, взаимодействующий с солью теллурита. С. diphtheriae var. gravis на этой среде образует мелкие, выпуклые, блестящие, черные колонии. Среда обладает селективными свойствами, посторонняя микрофлора растет слабо. Теллуровая среда Клауберга II. К 1000 мл расплавленного 3%-ного питательного агара прибавляют 3 мл 2%-ного раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл «лаковой крови». Среду разливают в чашки Петри (используют не более 3-4 суток) и хранят при 4-10° С. Коринебактерии дифтерии типа «gravis» образуют серовато-черные колонии с несколько изрезанными краями, типа «mitis» — мелкие, с ровными краями серовато-черные блестящие колонии. Приготовление «лаковой крови». К 3 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови крупного рогатого скота, добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина. Смесь выдерживают в холодильнике 3-6 недель. Кровяной теллуровый агар. К 100 мл расплавленного и охлажденного до 45-50° С питательного агара (рН 7,6-7,8) добавляют 10 мл дефибринированной крови лошади или крупного рогатого скота, 2 мл 2%-ного раствора теллурита калия (К,ТеО3). Полученную среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Колонии дифтерийных бактерий на этой среде имеют черный цвет или черный центр колонии, дифтероидов — более выпуклые, влажные, серого цвета, с коричневым центром, ложнодифтерийных бактерий — мелкие серые, с коричневым центром, непрозрачные. Среда Пергола. Используют как среду обогащения для выделения коринебактерии дифтерии. Из куриного яйца стерильно извлекают желток, переносят его в колбу с бусами и добавляют 100 мл стерильной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота, 1 мл 2%-ного раствора теллурита калия; тщательно перемешивают. Полученую смесь разливают по 2-3 мл в стерильные пробирки и прогревают 1 ч в водяной бане при 56° С. Затем для контроля стерильности выдерживают 48 ч в термостате при 37° С. На этой среде дифтерийные бактерии формируют через 12- Жидкая среда для дифтерийных микробов. К 400 мл стерильного бульона (рН 7,6), содержащего 10% сыворотки лошади или крупного рогатого скота, добавляют 75 мл «лаковой крови», 20 мл 1%-ного раствора теллурита калия, 12,5 мл глицериновой смеси и 12,5 мл 1%-ного цистина. Ацетатно-теллуритовый бульон для дифтерийных микробов. В колбе смешивают 200 мл МПБ (рН 7,4), 2 мл глицерина, 18 мл 50%-ного раствора пептона Витте и 0,63 мл 50%-ного раствора ацетата натрия. Среду стерилизуют текучим паром в течение 1 ч, охлаждают до 48° С и добавляют 10 мл 1%-ного раствора теллурита калия и 21 мл дефибринированной крови барана. Желточно-молочно-агаровая среда. К 1000 мл 4%-ного агара на мартеновском бульоне или МПБ (рН 7,6-7,8) добавляют 10 куриных желтков, эмульгируют и вносят 800 мл обезжиренного, стерильного молока. Компоненты перемешивают, готовую среду разливают по стерильным пробиркам, скашивают и дважды по 1 ч прогревают в аппарате Коха при 80° С. Среда Пай. В колбе смешивают 1000 мл содержимого куриных яиц и 500 мл дистиллированной воды, взбивают, фильтруют через двойной слой марли, добавляют 120 мл глицерина, 5 г декстрозы, перемешивают, разливают по стерильным пробиркам, скашивают и стерилизуют как свернутую сыворотку (см. среда Леффлера). Индикаторная среда III для дифтерийных бактерий. К 420 мл 3%-ного питательного агара добавляют 12,5 мл 1%-ного раствора цистина, 1,5 мл 50%-ного раствора ацетата натрия, 880 мл 1%-ного раствора теллурита калия. Устанавливают рН 8,0 и вносят 60 мл 2%-ного раствора индикатора водного голубого. В нагретую до 50-55° С среду добавляют смесь следующего состава: 280 мл дистиллированной воды, 21 мл глицериновой смеси (см.среда Клауберга II), 15 г глюкозы, 140 мл дефибринированной крови (рН смеси 7,0). После перемешивания среду разливают в чашки Петри. Сывороточная среда Леффлера. Рекомендуется для выращивания патогенных нейссерий, коринебактерии. Смешивают 750 мл сыворотки крови овцы, 250 мл МПБ (рН 7,0), 2,5 г декстрозы, 1,25 г натрия хлорида. Среду разливают в пробирки и свертывают в скошенном положении при 80° С 3 дня по 2ч в аппарате Коха или в сушильном шкафу при 70° С 3 дня по 1 ч.
|