Выделение и идентификация культуры C.botulinum

Пробы исследуемого материала, подготовленные, как указано выше, для обна­ружения ботулинического токсина высевают в жидкую среду Кита-Тароцци с 0,5% глюкозы в два флакона емкостью 100-200 мл. Оптимум рН питательных сред 7,0-7,6, температурный оптимум — 30-37° С. Максимальное накопление токсина типов А и Е наступает через 4 суток, типов В и С — через 5 суток, типа D — через 10 суток инкубирования посевов. После посева материала один флакон прогревают при 80° С в течение часа, другой не подверга­ют термической обработке. Прогревание уничтожает большую часть сопутству­ющей неспорообразующей микрофлоры и инициирует прорастание спор возбуди­теля. Споры возбудителя типа Е требуют обработки лизоцимом. Параллельно, с целью выделения чистой культуры возбудителя, материал высевают на глюкозо-кровяной агар Цейсслера в чашках Петри, которые инкубируют в анаэростатах с разрежением воздуха не более 5 мм ртутного столба или замещают воздух сме­сью водорода и СО₂ Посевы инкубируют при 35° С в течение 5 суток.

Рост возбудителя на жидкой питательной среде сопровождается ее постепен­ным помутнением (на 2-3-й сутки), газообразованием, появлением у культуры запаха прогорклого масла. Из выросших культур делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При обнаружении в мазках грамположительных палоч­ковидных бактерий (0,9-1,2x4-6мкм) субтерминальными спорами на 5-7-е сут­ки инкубирования проводят выявление токсина и его идентификацию в реакции нейтрализации на мышах, как описано выше. Смешанные первичные культуры могут быть посеяны на глюкозо-кровяной агар для получения чистой культуры.

Посевы исследуемого материала или первичных бульонных культур на глюкозо-кровяной агар просматривают на 2-4-е сутки инкубирования. Ко­лонии С. botulinum круглые или с корневидными отростками, бесцветные или сероватые, выпуклые, диаметром 2-6 мм, в большинстве случаев окруже­ны зоной β-гемолиза. При обнаружении в колониях бактериальных клеток, типичных для C. botulinum, культуры отвивают на оптимальные питательные среды, подвергают идентификации по биохимическим признакам, определя­ют наличие способности к токсинообразованию и тип токсина (см. выше). С целью видовой идентификации у культур исследуют наличие лецитиназы и липазы путем посева на желточный агар, определяют наличие желатиназы, казеиназы, способности образовывать индол, кислоту из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы. По перечисленным критериям культуры C. botulinum могут быть отнесены к одному из четырех ферментативных типов (табл. 60). Применяют тест-системы для анаэробов (см. ранее).

Таблица 60 - Ферментативные свойства C.botulinum

— варьирующий признак н.д. — нет данных