Питательные среды

Среда Кита-Тароцци. Мясо или печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным объемом МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4-7,6) и 30 минут кипятят. Затем среду фильтруют, печень (мясо) промывают водо­проводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой. По 3-4 кусочка мяса (печени) помещают в пробирку, наливают 7-8 мл бульона, покрывают слоем вазелинового масла и стерилизуют при 120° С 20 минут. Перед исполь­зованием среду регенерируют (кипятят с последующим охлаждением).

Кровяной агар с глюкозой. К 3%-ному МПА (рН 7,2-7,4), расплавленному и охлажденному до 50° С, добавляют до 1-2% стерильного раствора глюкозы, 15-20% све­жей дефибринированной крови барана или лошади. Разливают по чашкам Петри, подсушивают в термостате.

Полужидкий агар для строгих анаэробов (Тароцци). В бульон Мартена (рН 7,2-7,4) с 0,3-0,5% глюкозы добавляют 0,1% агара. Среду разливают по 9 мл в стерильные пробирки с кусочками варе­ного мяса, печени или фарша, стерилизуют при 120° С 30 минут. Среду можно использовать, не заливая поверхность вазелиновым маслом.

Мозговая среда (МС). Свежий мозг (не позже чем через 18 часов после убоя животного) очища­ют от пленок и пропускают через мясорубку. Мозговой фарш заливают во­допроводной водой (1 часть мозгового фарша на 1 часть воды) и протирают через сито. Реакция протертой массы должна быть нейтральной или слабо­щелочной. Стерилизуют текучим паром в течение 2 часов. Затем расклады­вают по пробиркам высоким столбиком и стерилизуют в течение 2 часов при 110° С. Для более быстрого почернения мозговой среды при культивирова­нии анаэробов рекомендуется добавить 0,05% сернокислого железа.

Агар для трубок Виньял-Вейона. В бульоне Мартена (рН 7,4) растворяют 2% агара, 0,1% глюкозы. Сре­ду разливают в узкие тонкостенные пробирки и стерилизуют дробно, теку­чим паром в течение 3 дней.

Бульон Вейнберга для анаэробов. 1 кг бычьего сердца пропускают через мясорубку, добавляют к фаршу 1 л воды, нагревают до кипения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г печени, 400 г свиных желудков, 40 г соляной кислоты, 4 л воды, подо­гретой до 50° С, и выдерживают при этой температуре 18-24 ч. Затем подогревают до 100° С, жидкость сливают, фильтруют, добавляют 0,2% двуосновного фосфорнокислого натрия и устанавливают рН 7,4, смеши­вают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л полученного пептона, устанав­ливают рН 7,8-8,2 и стерилизуют при 120° С 30 минут. Бульон разливают по пробиркам с кусочками вареной печени, наливают стерильное вазели­новое масло слоем 0,5 см и вновь стерилизуют при 120° С 30 минут. Перед посевом к бульону добавляют стерильный раствор глюкозы до 0,5%.

Среда Виллиса и Хоббс. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 глюкозы, 1,3 мл 1%-ного раствора нейтрального красного. Стерилизуют при 115° С 15 ми­нут, охлаждают до 50° С и добавляют 15 мл стерильной желточной суспен­зии (смешивают поровну куриный желток, физиологический раствор и 60 мл стерильного обезжиренного молока).

Железосульфитный агар (Вильсон - Блер). К 100 мл 3%-ного МПА (рН 7,4) с 1% глюкозы при температуре 60° С добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернокислого натрия (Na₂SО₄) и 1 мл 8%-ного раствора хлористого железа (FeCl₃), приготовленного на стериль­ной дистиллированной воде. Раствор Na₂SО₄ предварительно стерилизуют 1 ч текучим паром. Затем среду, не стерилизуя, разливают по чашкам Пет­ри. Сернокислый натрий можно заменить серноватистокислым натрием (Na₂S₄О₄), а хлористое железо — сернокислым (FeSО₄). Сульфат натрия соединяется с хлорным железом, и образуется черный осадок сернистого же­леза (FeS). Этой способностью обладают анаэробы и некоторые аэробные бактерии, вследствие чего колонии таких микроорганизмов окрашивают­ся в черный цвет. С. perfringens, обладающий большой скоростью роста, изменяет цвет среды через 1-2 ч культивирования. Другие анаэробы фор­мируют зеленовато-черные колонии через 6-7 ч.

Молочные среды. Молоко отстаивают и удаляют верхний жировой слой. Обезжиренное молоко разливают высоким столбиком в пробирки, в которые предвари­тельно укладывают кусочки вареной печени, и стерилизуют 3 дня при тем­пературе 100° С по 20 минут.

Железо-сульфитное молоко. К 100 мл обезжиренного молока добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернистокислого натрия и 1 мл 8%-ного хлористого железа. Среду готовят непосредственно перед использованием и разливают по пробиркам. На дан­ной среде С. perfringens можно обнаружить в смеси со стрептококками, ко­торые на других средах способны заметно тормозить его рост.

Бензидино-кровяной агар. К 3%-ному МПА (рН 6,4) с 1% глюкозы, подогретому до температуры 50° С, добавляют бензидин до концентрации 9% и 10% стерильной дефибринированной крови барана. Компоненты перемешивают до приобретения средой шоколадного оттенка, разливают по чашкам Петри и подсушива­ют 4-5 ч в термостате. Засеянные чашки выдерживают в анаэробных ус­ловиях в термостате 12-24 ч, а затем переносят в аэробные условия. Коло­нии С. novyi окрашиваются в черный цвет за 15-30 мин. Раствор бензидина готовят следующим образом: к 50 мл дистиллированной воды добавля­ют 0,25 г основного бензидина, 0,3 мл 1% НС1 и нагревают до растворения. Раствор пригоден для употребления в течение 2 недель

Желточно-кровяной агар Шапина — Вегина. К2,5%-ному МПА добавляют 10% дефибринированной крови барана, 10% желточной взвеси. Среда предназначена для выявления С. novyi. Че­рез 16 ч выращивания колонии окружены непрозрачной зоной гемолиза с наличием на поверхности среды вокруг колоний непрозрачной пленки с жемчужным блеском. Другие бактерии (аэробы, анаэробы), как правило, не дают одновременно перламутрового слоя и зоны редукции.

Полусинтетическая среда. Используют для культивирования и быстрой селекции анаэробных бак­терий. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г пептона, 5 г дрож­жевого экстракта, 2,5 г натрия хлорида, 1,3 г агар-агара и подщелачивают. Смесь автоклавируют при 120° С в течение 15 минут, фильтруют, добавляют 5,5 г глюкозы, 0,5 г гидросульфита натрия, предварительно растворенных в небольшом количестве воды, устанавливают рН 7,1. Добавляют 0,001 г ре-зазурина и встряхивают смесь в течение нескольких минут. Среду разливают в пробирки по 15 мл, стерилизуют при 110° С 30 минут, охлаждают под хо­лодной водой. При росте анаэробов среда окрашивается в нижней части пробирки, факультативных анаэробов — весь столбик среды. Среду исполь­зуют 3 недели при хранении в условиях комнатной температуры.

Перфрингенс-агар (O.P.SJP.-arap, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г триптона, 5 г дрож­жевого экстракта, 5 г соевого пептона, 7 г печеночного экстракта, 1 г же­леза аммонийно-цитратного, 1 г натрия метабисульфита, 1,5 г трис-буфера, 10 г агара, устанавливают рН 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121° С 15 минут, затем охлаждают до 50° С, вносят добавки (стериль­но), обеспечивающие среде селективные свойства, и разливают по чашкам Петри. Добавка «А» содержит 100 мл натрия сульфадиазиана, добавка «В» — 0,5 г олеандомицина фосфата и 10 ЕД полимиксина В сульфата. Среда содержит из 100 мкг/мл натрия сульфадиазина,
0,5 мкг/мл олеандо­мицина фосфата и 10 ЕД полимиксина В сульфата. Данный состав обеспе­чивает селективные свойства, оптимальные для изоляции С. perfringens. Натрия метабисульфат и аммонийно-цитратное железо являются индикато­рами редукции сульфита, что влияет на формирование колоний возбудите­ля черного цвета диаметром 2-4 мм. Рост других сульфитредуцирующих бактерий (сальмонеллы, протей, цитробактер, стафилококки, бациллы) ингибируется. На среде могут расти энтерококки, но их колонии по внешнему виду отличаются от колоний
С. perfringens.

Анаэробный агар Шедлера (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптического со­евого бульона, 5 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г декстрозы, 0,4 г цистеина гидрохлорида, 0,01 г гемина, 0,75 г трис-буфера, 13,5 г агара. Ус­танавливают рН 7,6, стерилизуют автоклавированием при 121° С 15 ми­нут. С селективными добавками среду используют для выделения клостри-дий, бактероидов, флавобактерий, лактобацилл, стрептококков (анаэроб­ных) из проб фекалий и кишечного тракта. Для изоляции клостридий и бак­тероидов в 1000 мл основного анаэробного агара добавляют 10 г порошка плаценты и 0,002 г неомицина. С целью выделения флавобактерий в 1000 мл вносят 7 мл 0,5%-ного тиротрицина в этаноле. Для анаэробных лактоба­цилл и стрептококков в 1000 мл вносят 10 г натрия хлорида и 0,002 г нео­мицина. Посевы инкубируют при 37° С в анаэробных условиях.

Основной перфрингенс-агар (пропись фирмы «Дифко», 1982). Среду используют для изготовления TSC- или SFP-arapa при предвари­тельной идентификации и подсчете С. perfringens. В 1000 мл дистиллиро­ванной воды растворяют триптозы — 15 г, соевого пептона — 5 г, мясного экстракта (сухого) — 5 г, дрожжевого экстракта — 5 г, натрия метабисуль­фита — 1 г, железа аммонийноцитратного — 1 г, агара — 14 г. Устанавли­вают рН 7,6, стерилизуют при 121° С 10 минут. Затем среду охлаждают до 50° С и вносят соответствующие селективные добавки.

Триптозо-сульфитный циклосериновый агар (TSC-arap). В основной перфрингенс-агар вносят D-циклосерин из расчета 400 мг/л и 50 мл/л желточной эмульсии. Компоненты перемешивают и готовую сре­ду разливают в чашки Петри.

Перфрингенс-агар Шахиди-Фергусона (SFP-arap). В основной перфрингенс-агар вносят следующие антибиотики: 12 мг/л канамицин-сульфат, 30000 ЕД/л полимиксин В сульфата и 50 мл/л желточ­ной эмульсии. Готовую среду разливают в чашки Петри. На обеих указан­ных средах вокруг черных колоний С. perfringens образуется опалесцирующая зона, указывающая на лецитиназную активность микроорганизма.

Анаэробный бульон Шедлера. По составу среда аналогична анаэробному агару Шедлера, но из нее исключен агар. Используют для выращивания патогенных анаэробов, для определения антибиотикоустойчивости анаэробов методом разведения с выражением результата в виде МИК.

Тиогликолятный бульон. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г L-цистина, 2,5 г NaCl, 5,5 г декстрозы, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г панкреатического перевара казеина, 0,5 г натрия тиогликолята. Устанавливают рН 7,1, раз­ливают по емкостям и стерилизуют при 121° С 15 минут. Перед использова­нием среду кипятят и охлаждают. Рекомендуется для контроля контамина­ции различных материалов анаэробными бактериями.

Анаэробный агар Уилкинса - Чангрена. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 гтриптона, 10 г же­латинового пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г декстрозы, 5 г NaCl, 1 г L-аргинина, 1 г натрия пирувата, 0,0005 г менадиона, 0,005 г гемина, 10 г агара. Устанавливают рН 7,1, стерилизуют при 121° С 15 минут. Сре­да рекомендуется для изоляции анаэробных микроорганизмов из клиничес­ких материалов, является стандартной для определения антибиотикочув-ствительности анаэробных бактерий. При исключении агара среда может быть использована как питательный бульон.

Обогащенный клостридиальный агар (RCM-arap). В 1000 йл дистиллированной воды растворяют 3 г дрожжевого эк­стракта, 10 г мясного экстракта, 10 г пептона, 5 г декстрозы, 1 г ра­створимого крахмала, 5 г натрия хлорида, 3 г натрия ацетата, 0,5 г цистеина гидрохлорида, 15 г агара. Устанавливают рН 6,8, стерили­зуют при 121° С 15 минут. Среда рекомендуется для исследования ки­шечной микрофлоры. С добавками крови она пригодна для обнаружения в фецес животных и людей лактобацилл, с добавками крови и неомицина — бактероидов.

Кровяной агар для Clostridium chauvoei. Состав: питательный бульон — 94 мл; печеночной экстракт (Oxoid) — 3,2 г; глюкоза — 1,0 г; агар — 1,6 г; дефибрииированная кровь овцы — 5,0 мл. Приготовление: бульон, печеночный экстракт, глюкозу и агар сме­шивают и автоклавируют при 115° С в течение 10 минут. К остуженной среде (50° С) добавляют кровь и среду разливают в чашки Петри.

Полужидкий агар для определения ферментативной активности анаэ­робов. Для устранения углеводов, которые могут быть в мясе, среда должна быть приготовлена на сброженной мясной воде. Сброженная мясная вода: 500 г мясного фарша заливают 1 л теплой (37° С) водопроводной воды, до­бавляют 5-7 г обычных пекарских дрожжей, перемешивают и ставят в тер­мостат на 18 часов. Мясо отжимают через полотно, полученную жидкость кипятят, фильтруют, разливают в колбы (по 500 мл) и стерилизуют при тем­пературе 115-120° С в течение 15-20 минут. Сброженную мясную воду можно заготавливать впрок и употреблять по мере надобности.

Картофельный бульон Нечаевской и Старобинец. Тщательно вымытый и мелко нарезанный картофель заливают водой из расчета на 1 кг картофеля 2 л воды, стерилизуют при 2 атмосферах в течение 10 минут, затем фильтруют через вату или марлю в горячем виде. К фильтрату добавляют 1% сухого пептона и 0,5% поваренной соли, устанавливают рН 7,2-7,4 и вновь фильтруют. Полученную светло-желтую прозрачную жид­кость разливают по пробиркам или флаконам, в которые помещают кусочки вареного картофеля и наслаивают вазелиновое масло; стерилизуют 20 минут при 1 атмосфере. Для приготовления твердой среды к бульону добавляют 2-3% агара и стерилизуют.

На картофельных средах все анаэробы не теряют своих патогенных и токсигенных свойств и хорошо растут.

Полужидкий агар с углеводами и индикатором. В 500 мл сброженной мясной воды добавляют 2% пептона и 0,5% хлористо­го натрия, устанавливают рН 7,4 и кипятят до растворения пептона. Отлива­ют 100 мл пептонной мясной воды и растворяют 3,5 г сухого кристаллическо­го лакмуса, предварительно проведенного через спирт. К оставшимся 400 мл мясной пептонной воды добавляют 0,25% агара (на 500 мл) и расплавляют в автоклаве.

К горячему агару добавляют 100 мл мясо-пептонной воды с лакмусом. Для улучшения буферности среды добавляют 0,2% двуметаллического фос­форнокислого натрия.

Агар с лакмусом разливают по колбам из расчета количества имеющих­ся в лаборатории испытуемых Сахаров. В каждую колбу вносят 2% испыту­емого сахара. После растворения сахара агар разливают по пробиркам высоким столбиком и дробно стерилизуют текучим паром 3 дня по 15 ми­нут. Посев производят в расплавленный и остуженный до 40° С полужид кий агар. Лакмус можно заменить индикатором Андраде (5 мл). Приготов­ление индикатора Андраде: 0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл ди­стиллированной воды и прибавляют 16 мл нормального раствора едкого натра. Фуксин довольно быстро обесцвечивается.

При определении ферментативной активности анаэробов методом посе­ва в полужидкий агар необходимо учитывать, что в глубине пробирки сре­да чаще всего имеет цвет бульона, а не индикатора, и только в верхнем слое, куда легко диффундирует кислород воздуха, отмечается покраснение в случае разложения данного сахара с образованием кислоты или посине­ние при отсутствии его ферментации. В глубине среды благодаря отсут­ствию кислорода лакмус переходит в свою бесцветную фазу. Чтобы уста­новить изменение среды, необходимо убедиться в наличии роста; в против­ном случае нельзя судить об отношении микроба к данному углеводу.