Питательные среды. Среда Stonebrinks для M. bovis

Среда Stonebrinks для M. bovis. Компоненты. Солевой раствор: натрия пируват — 5 г, КН₂Р0₄ — 2 г, дистиллированная вода — 300 мл.

Смесь красителей: кристаллвиолет — 100 мг, малахитовый зеленый — 800 мг, дистиллированная вода — 100 мл; 20 свежих куриных яиц.

Приготовление среды: устанавливают рН солевого раствора добавле­нием раствора Na₂HPO на уровне 6,5. Раствор разливают в емкости по 100 мл. Оба раствора стерилизуют при 121 °С в течение 15 минут. Яйца моют, высушивают и помещают на 30 минут в 75%-ный изопропиловый спирт. Под­сушивают яйца на воздухе под ультрафиолетовыми лучами, вскрывают, содержимое помещают в емкость с раствором и гомогенизируют. Получен­ную смесь разливают по 12 мл в пробирки, которые в наклонном положе­нии выдерживают 40-60 минут в водяной бане при 80°С. Остужают 30 минут и инкубируют при 37°С 24-48 часов для впитывания влаги в среду.

Модифицированная среда Дюбо-Смита. Компоненты: К₂НР0₄ —
4 г, Na₂HP0₄ — 6,25 г, MgS0₄ — 0,01 г, СаС1₂— 0,0005 г, ZnS0₄ — 0,0001 г, CuS0₄ — 0,0001 г, лимоннокислое аммонийное железо — 0,05 г, аспарагин — 1 г, гидролизат казеина — 80 мл, спиртовой экстракт M. phlei —
20 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота — до 20%, пенициллин — 50 ЕД/мл, агарДифко — 15 г, дистиллиро­ванная вода — до 1000 мл.

Применяют для культивирования M. paraluberculosis.

Среда Петраньяни. Встерильную колбу со стеклянными шариками вносят 250 мл свежего цельного молока, 6 г картофельной муки, 1 г пептона, одну мелко нарезан­ную картофелину размером с куриное яйцо. Помешивая, выдерживают кол­бу с содержимым в кипящей водяной бане 10 минут, охлаждают до 60° С и вносят 1 желток и содержимое 4 свежих яиц, 12 мл стерильного глицерина, 6 мл 2%-ного (на дистиллированной воде) раствора малахитового зеленого. Компоненты перемешивают, фильтруют через двойной слой марли, разлива­ют по стерильным пробиркам и свертывают в наклонном положении в аппа­рате Коха при 85° С 30 минут. В последующие двое суток прогревают до 70° С по 15 минут. Готовая среда светло-зеленого цвета. Хранят на холоде.

Среда Левенштейна - Иенсена. Готовят солевой раствор следующего состава: в 600 мл дистиллирован­ной воды растворяют первоначально 2,4 г одноосновного фосфата калия, далее последовательно 0,24 г сульфата магнезии, 3,6 г L-аспаргина, 12 г хи­мически чистого глицерина. Раствор стерилизуют текучим паром 120 минут, добавляют 30 г картофельного крахмала, разливают в колбы по 150 мл и нагревают 8 кипящей водяной бане до загустения смеси. Затем готовят яич­ную массу. В литровую термо колбу с бусами асептично вносят содержимое 20-22 куриных яиц (свежих), перемешивают, фильтруют через мар­лю. К 1000 мл яичной смеси добавляют 200 мл стерильного 2%-ного раство­ра малахитового зеленого и перемешивают. К 1 л яичной смеси с малахито­вым зеленым добавляют 600 мл солевого раствора с крахмалом, выдержива­ют около 1 часа до исчезновения пузырьков, асептично разливают по 8-10 мл пробирки и в скошенном положении в аппарате Коха прогревают при 80-85° С 40 минут. Далее среду выдерживают в термостате для контроля стерильности. Хранят на холоде. Если среду используют для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, крахмал не добавляют.

Яичная среда Гельберга. Пять свежих куриных яиц моют, обтирают спиртом, слегка обжигают, вскры­вают. Асептично извлекают два желтка и помещают их в стерильную колбу с бусами, встряхивают. Добавляют 50 мл солевого раствора, 50 мл молока, 50 мл картофельного отвара, 2,5 мл 10%-ного стерильного раствора лимонной кисло­ты. Компоненты перемешивают, добавляют 3,5 мл 2%-ного стерильного раство­ра малахитового зеленого и вновь содержимое колбы тщательно перемешивают. Смесь фильтруют через стерильную марлю и по 4-6 мл разливают в пробирки. Стерилизуют в аппарате Коха при 85° С 60 минут однократно. Готовую питатель­ную среду для контроля стерильности выдерживают 48 часов в термостате. Ис­пользуют в течение недели после изготовления при хранении на холоде.

Приготовление картофельного отвара. Очищенный и нарезанный кар­тофель заливают двойным количеством воды (вес/вес), кипятят 15 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют при 120° С 20 минут.

Приготовление молока. Снятое коровье молоко разливают по 110 мл в колбы, стерилизуют первый день при 105°С 10 минут, второй - 15 минут текучим паром. Раствор малахитового зеленого (2%-ный) стерилизуют при 120° С 20 минут. Кри­сталлическую лимонную кислоту (10 г) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют 20 минут при 120° С.

Приготовление солевого раствора. Берут К₂НР0₄ — 1 г, натрия лимон­нокислого — 1 г, магнезии сернокислой — 1 г, пептона —2,6 г, глицерина химически чистого — 30 мл, воды дистиллированной — до 1000 мл. Каж­дый компонент растворяют в небольшом количестве воды, потом вносят глицерин и добавляют дистиллированную воду до 1000 мл. Смесь слегка подогревают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют 20 минут при 105° С.

Картофель Павловского. Белый картофель тщательно моют с мылом, насухо вытирают, очища­ют, прокаленным ножом срезают оба полюса картофелины. Специальным стерильным буром вырезают из картофеля цилиндр длиной 5-6 см и шири­ной в соответствии с диаметром пробирки. Цилиндры по диагонали разре­зают на 2 клина и опускают последние в 5%-ную стерильную глицерино­вую воду на 1-2 часа.

Далее клинья подсушивают при помощи стерильной фильтровальной бумаги и пинцетом опускают в пробирки Ру с перетяжкой, содержащие в нижней части 5%-ную стерильную глицериновую воду (рН 7,0-7,2), с рас­четом, чтобы нижняя часть картофельного клина касалась жидкости. Про­бирки стерилизуют при 110° С 10 минут. Сразу после стерилизации пробир­ки размещают в наклонном положении поверхностью посевов вниз, что позволяет сохранить их влажными. Стерильность контролируют термостатированием.

Среда Петрова. Смешивают 500 г мясного говяжьего фарша с 500 мл 15%-ной глицери­новой воды и выдерживают на холоде 24 часа. Перед употреблением филь­труют. Асептически извлекают содержимое куриных яиц, помещают в мер­ный цилиндр и перемешивают. Далее готовят 1%-ный раствор генцианвиолета и выдерживают 24 часа в термостате.

Для изготовления сред в одну часть мясного настоя вносят 2 части яичной смеси и 1 мл раствора генцианвиолета на каждые 100 мл среды. Компоненты тщательно перемешивают, разливают по пробиркам и прогревают первый день при 85° С, а два последующих дня — при 75° С по 40-60 минут. Готовую среду контролируют на стерильность, выдерживая в термостате 3-5 дней.

Яично-картофельная среда Виноградова. Вымытый, очищенный и нарезанный мелкими кусочками картофель залива­ют водой (1:2) и варят при 120° С 1,5 часа. Горячий отвар фильтруют через марлю. В фильтрат вносят 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 5% глицерина. Смесь стерилизуют в автоклаве и используют по мере необходимости. При изго­товлении среды к 1 части картофельного отвара добавляют 2 части яичной смеси, перемешивают, разливают по пробиркам, прогревают при 90° С. Затем в каж­дую пробирку вносят 0,5-1,0 мл МПБ с глицерином или картофельного отвара и повторно стерилизуют при 100° С два дня по 45 минут.

Среда Дорсе. Вымытые куриные яйца помещают на 10-15 минут в сосуд с этиловым спиртом, затем обжигают на пламени горелки, содержимое асептично пере­носят в колбу с известным весом и доливают 10% (вес/вес) дистиллирован­ной воды. Смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и свертывают в наклонном положении при 70-75° С 60 минут. Контролируют на стерильность, выдерживая в термостате трое суток.

Среда Международной лиги борьбы с туберкулезом. Среда Левенштейна-Иенсена без крахмала. Пробки в пробирках гер­метизируют парафином, хранят при 4° С. Среда пригодна для использова­ния в течение полугода.

Кислотная яичная среда № 1a. В 600 мл дистиллированной воды растворяют 6,3 г КН₂Р0₄, 0,3 г MgS0₄, 12 мл глицерина и автоклавируют при 110° С15 минут. К раствору асептически добавляют 1100 мл полной яичной смеси, 3 мл 1N НС1,11 мл раствора малахи­тового зеленого (2%-ный, вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пеницилли­на. Среду разливают по пробиркам, прогревают при 75-78° С 45 минут.

Кислотная яичная среда № 1в. Готовится аналогично среде 1а, но вместо глицерина добавляют 7 г на­трия пирувата.

Кровяная среда. Непосредственно перед посевом дистиллированной водой разводят 1:2 стерильную цитратную кровь, разливают по 3 мл в пробирки и вносят ра­створ пенициллина из расчета 2 ЕД/мл.

Синтетическая среда Вишневского. Берут 3 г аспарагина, 7 г щавелевокислого аммония, 5 г двухосновного фосфорнокислого магния, 0,5 г сернокислого магния, 0,05 г сернокислого железа, 40 мл глицерина и дистиллированной воды до 1000 мл. Подщела­чивают до рН 6,8-7,2, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 минут при 120° С.

Среда Данкина. Используют для культивирования M. paratuberculosis. На 4%-ном гли­цериновом бульоне выращивают 10-15 суток культуру M. phlei. Путем фильтрации через бумажный фильтр отделяют бактериальную массу, пере­носят ее в ступку с 10 мл глицерина и 100 мл печеночного экстракта Дедляу. Смесь несколько минут кипятят, отстаивают и надосадочную жидкость сливают в мерный сосуд, добавляют содержимое трех куриных яиц. Пере­мешивают и вносят 2,5% (объем/объем) 1%-ного спиртового раствора ген-цианвиолета. Фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробир­кам и помещают в аппарат для свертывания. Стерилизуют дробно, первый день при 80° С до уплотнения среды и два дня подряд по 60 минут при 80° С.

Печеночный экстракт по Дедляу. В 1000 мл воды вносят 400 г говяжьей печени, стерилизуют 120 минут текучим паром и фильтруют через марлю. Устанавливают рН — 7,0. Филь­трат разливают по емкостям и стерилизуют при 100° С по 20 минут в тече­ние трех дней.

Среда Ренжара. Используют для культивирования M. paratuberculosis. Смешивают 4 части печеночного (рН 7,3) и 8 частей телячьего бульона (рН 7,3), добавляют 3% агар-агара. После растворения агара смесь фильтруют, вносят 5% глицерина и 1 часть глицериновой вытяжки M.phlei, стерилизуют при 115° С 20 минут. Среду охлаждают до 55° С. Добавляют
1 часть сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при 56-58° С, разливают по пробиркам и скашивают.

Приготовление вытяжки из M. phlei. Бактериальную массу из M.phlei, выращенную на глицериновом бульо­не, фильтруют через бумажный фильтр, 5 г биомассы растирают с 30 мл 20%-ного раствора глицерина в дистиллированной воде, встряхивают, прогревают при 110-120° С
1,5 часа. Центрифугированием отделяют жид­кую часть, которую и используют для приготовления среды.

Приготовление спиртового экстракта из М. phlei (микобактин). Культуру микобактерий Тимофеевой травы выращивают в МПБ (4% пепто­на, 10% глицерина, рН 7,2) в течение 3-4 недель, фильтруют через бумажный фильтр. Осадок промывают стерильной дистиллированной водой, прогревают в аппарате Коха при 80° С в течение 30 минут, высушивают в эксикаторе над СаС1₂ или в термостате при 45° С и растирают в порошок. 20 г порошка вносят в 150 мл этанола и трехкратно экстрагируют кипячением в колбе с обратным хо­лодильником. Все порции экстракта объединяют и оставляют на ночь.

Надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр, сливают в кол­бу, сгущают при пониженном давлении до формирования вязкой красновато-оранжевой жидкости, которую смешивают с 80 мл 50%-ного раствора глицери­на на дистиллированной воде. Устанавливают рН 7,6, прогревают в кипящей водяной бане 10 минут. Затем жидкость помещают в делительную воронку и оставляют на ночь. Экстракт хранят при комнатной температуре.