Выделение и идентификация культуры возбудителя. Культивирование. Листерии — факультативные анаэробы, температурный диапазон 4-45° С, оптимум — 30-37° С; оптимальный рН питательных сред 7,2-7,4

Культивирование. Листерии — факультативные анаэробы, температурный диапазон 4-45° С, оптимум — 30-37° С; оптимальный рН питательных сред 7,2-7,4, диапазон рН 5,6-9,6. С целью выявления способности к образованию жгу­тиков культивирование необходимо проводить при 20-25° С. Все штаммы листерий растут на средах с 10% NaCl, на агаре Мак-Конки, в присутствии 0,025% ацетата таллия, 0,01 хлорида 2,3, 5-трифенилтетразолия, 0,04% теллурита таллия, но не растут в присутствии цианида калия и 0,02% азида натрия.

Исследуемый материал высевают на МПА, МПБ, печеночный агар и бульон с добавлением 1% глюкозы и 2-3% глицерина, кровяной агар. Из паренхиматозных органов делают обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию на стерильном физиологическом раство­ре (1:5), которую высевают на среду. У абортированных плодов посевы производят из органов и содержимого желудка. Ис­пользуя способность листерий к размножению при низких температурах, параллельно с обычными посевами можно сохранять материал при 4° С в холодильнике (в 30%-ном глицерине) в течение 30 дней и при отрицатель­ных первичных посевах через каждые 10 дней из материала делают повтор­ные посевы. Кроме того, используя это же свойство листерий, можно производить высевы из парен­химатозных органов, головного мозга на питательный бульон и посевы ин­кубировать при 4° С в течение 1-6 месяцев с периодическим их просмот­ром и высевом на плотные среды. В жидкие питательные среды в этом слу­чае рекомендуется добавлять для подавления роста сопутствующей микро­флоры 15-25 ЕД/мл полимиксина.

Молоко, истечения из половых органов и другой контаминированный ма­териал высевают на селективные среды: среда с теллуритом калия и флоримицином или полимиксином, среды с теллуритом калия, МПБ с 10% натрия хло­рида. Кроме того, может быть использована среда с ацетатом таллия и нали­диксовой кислотой, среда с налидиксовой кислотой, тиоцинатом калия, трипафлавином и налидиксовой кислотой. При использовании двух первых сред 1-2 мл исследуемого материала засевают в две колбы со 100-200 мл среды обогащения. Посевы в одном сосуде культивируют при 37° С, в другом при 4° С. Из первой колбы ежедневно, на протяжении 7 суток, отсевают 0,1 мл на плотную среду, инкубируют и исследуют в косопроходящем пучке света ха­рактер выросших колоний. Образец, инкубируемый при 4° С, исследуют ана­логичным образом через каждые 7 дней в течение 2 месяцев. При посеве на агар с трипафлавином и налидиксовой кислотой инкубирование проводят при 37° С в течение 24-48 часов.

Для исследо­вания контаминированного материала (слизь влагалищная, из матки, фе­калии и др.) помещают в пробирки с 5 мл бульона для листерий, из тканей и фекалий готовят в бульоне 10%-ную суспензию. Бульон с мате­риалом хранят при 4° С. В первые четыре недели посевы производят ежене­дельно, путем внесения 0,2 мл суспензии в пробирку с
5 мл бульона для листерий, содержащего тиацинат калия и инкубируют 48 часов при 25° С. Для получения изолированных колоний производят посев бактериологи­ческой петлей из верхней части суспензии на селективные плотные среды для листерий.

Рекомендуют высевать контаминированный мате­риал на МПБ с 0,01% таллурита калия и 15 ЕД/мл флоримицина с последу­ющей отвивкой культуры на МПА с 0,004% налидиксовой кислоты или первоначально посевы делать на обычный МПБ и затем отвивать культуру на МПА с 3,75% роданистого калия или МПА с 0,01% теллурита калия и флоримицином. Посевы инкубируют при 37° С в обычной атмосфере. Про­сматривают посевы ежедневно в первые 3-4 дня, наблюдая до двух не­дель. Культивирование посевов при 5-10% СО₂ обеспечивает лучший рост листерий. Широкое применение для изоляции листерий получили Оксфорд-агар и PALCAM-агар.

Следует отметить, что метод холодового обогащения при 4° С из-за дли­тельности инкубирования посевов неудобен, несмотря на его высокую эф­фективность и обычно рекомендуется проводить инкубацию первичных по­севов в жидкой накопительной среде при 30° С в течение 24-48 часов с последующим высевом на селективный агар. Жидкая среда обогащения в качестве селективных факторов содержит акрифлавин, налидиксовую кислоту, циклогексимид.

Характер роста L. monocytogenes на питательных средах. В МПБ рост возбудителя в первые сутки сопровождается легким равномер­ным помутнением среды. Через 4-7 суток на дне пробирки образуется слизис­тый осадок. Диссоциированные культуры могут вызывать образование на по­верхности среды пленки, хлопьевидный или крошковидный осадок на дне про­бирки.

На плотных средах первичные посевы обязательно просматривают с интервалом в несколько дней в косопроходящем пучке света. Колонии листерий мелкие, росинчатые, круглые, выпуклые, про­зрачные, диаметром 0,2-3 мм, с голубоватым оттенком и мелкозернистой структурой
(S-форма), в проходящем свете имеют сине-зеленый цвет. На кровяном (овечьем) агаре образуется узкая зона гемолиза. Могут наблю­даться R- и SR-формы. Колонии R-формы нередко состоят из нитевидных клеток, гемолитическая активность выражена слабо. На Оксфорд-агаре колонии листерий имеют черный цвет и окружены черным ореолом. На PALCAM-arape колонии серо-зеленые с черным вогнутым центром, чер­ным ореолом на красном фоне агара. На полужидком агаре (0,2%) возбудитель растет вначале по уколу в виде серо-белого хлопьевидного штыря с последующим распространением по всему столбику питательной среды. Смешанные культуры очищают дроб­ным рассевом на плотные питательные среды или путем заражения белых мышей.

Морфология листерий в культуре. Морфологию клеток изучают в препаратах, окрашенных по мето­ду Грама, а также проводят идентификацию выделенной культуры мето­дом флуоресцирующих антител. В молодых культурах преобладают клет­ки палочковидной формы, в старых могут наблюдаться нитевидные клет­ки, в выращенных при 37° С — кокковидной формы. В 2-5-дневных куль­турах часть клеток начинает окрашиваться грамотрицательно.

Идентификация листерий на уровне рода и вида. Виды рода Listeria сходны по ряду признаков с бактериями, объединен­ными в условную, не имеющую таксономического значения, группу «Грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы». И на первом этапе исследования нередко приходится дифференцировать листе­рий от бактерий родов Erysipelothrix, Lactobacillus, Kurthia, Caryophanon, Brochothrix, Renibacterium, входящих в данную группу. Для этой цели не­обходимо после определения морфологии и тинкториальных свойств кле­ток провести культивирование идентифицируемой культуры в аэробных и анаэробных условиях и определить ее способность выделять каталазу. По типу дыхания и каталазной активности все бактерии данной группы можно разбить на три подгруппы: аэробы — виды родов Kurthia, Caryophanon, Renibacterium; каталазопозитивные факультативные анаэробы или микроаэрофилы — виды родов Listeria и Brochothrix; каталазонегативные фа­культативные анаэробы — виды родов Erysipelothrix, Lactobacillus. Для дифференциации листерий от лактобацилл дополнительно культуру можно высеять на МРС-среду, на которой в отличие от молочнокислых бактерий листерий не растут или растут очень плохо.

В качестве дополнительных тестов для дифференциации листерий от эризипелотриксов рекомендуется посев испытуемой культуры (бульонная, смыв агаровой) в количестве 2-4 капель в индикаторные среды: с лакмусом, нейтральротом в смеси с метиленовым синим, метилротом, конгоротом амидочерным. Пробирки после встряхивания инкубируют вместе с незасеянными контрольными пробирками при 37° С. Результат учитывают через 3, 6, 24 и 48 часов. Листерий через 3-6 часов обесцвечивают среду с нейтральротом и метиленовым синим, лакмусом. Встряхивать пробирки нельзя, так как цвет может частично восстановить­ся. Среда с метилротом обесцвечивается через 3-6 часов, но восстановле­ния среды не наблюдается. Среды с конгоротом и амидочерным обесцвечи­ваются позднее (6-48 часов), и цвет среды не восстанавливается. Эризипелотриксы указанные среды не обесцвечивают.

Так же исследуют способность культуры расщеплять салицин и эскулин. Листерий разлагают с образованием кислоты оба субстрата. В свою очередь дифференциацию родов Listeria и Brochothrix проводят по на­личию жгутиков и способности к росту при 37° С. Для этого выращива­ют культуру в оптимальной питательной среде при 20-25° С и 37° С. Листерий обладают подвижностью при 20-25° С, но неподвижны при 37° С. Бактерии рода Brochothris не растут при 37° С и не образуют жгутиков при обоих температурных режимах. В косопроходящем пучке света колонии наиболее сходного с листериями вида В. thormosphacta отличаются от колоний листерий. Кроме того, В. thormosphacta не гидролизует гиппурат и не образует кислоту из многих Сахаров, расщепля­емых листериями.

В конечном итоге для дальнейшего изучения отбирают культуры бакте­рий с типичными для листерий культурально-морфологическими, тинкториальными свойствами, являющиеся подвижными при 20-25° С, каталазоположительными.

Важным таксономическим признаком как для родовой, так и для видо­вой идентификации листерий является обнаружение в ходе исследования у культуры патогенных свойств. При видовой идентифика­ции из-за высокого фенотипического сходства между штаммами L. monocytogenes,
L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri и L. welshimori исследу­емые штаммы в первую очередь проверяют на патогенность для мышей и гемолитическую активность.

Критерии дифференциации отдельных видов листерий по ферментатив­ным свойствам и патогенности представлены в таблице 1. У исследуемой культуры необходимо определить гемолитические свойства посевом на кро­вяной агар, скрытую гемолитическую активность в САМР-тесте со S. aureus или R. equi, гидролиз гиппурата, восстановление нитрата, образование кислоты из маннита, L-метил-D-маннозида, L-рамнозы, D-ксилозы и пато­генность для белых мышей.

Целесообразно использование микротеста системы API Listeria (BioMericux) и ее аналогов. Рекомендуется для изучения ферментатив­ных свойств делать посев бульонной культуры на среды с глюкозой, маль тозой, маннитом, салицином, трегалазой, дульцитом, инулином, раффиназой. Посевы инкубируют при 37°С в течение 10 суток. Для листерий (L. monocytogenes) характерно расщепление с образованием кислоты без газа глюкозы, мальтозы, дульцита, раффинозы, рамнозы.

Идентификация листерий при помощи бактериофагов. Используют два фага (L 2 А и L 4A), позволяющих идентифицировать до 85% штаммов L. monocytogenes. Лиофилизированные фаги растворяют в МПБ и используют в течение 5-10 суток при условии хранения в холодильнике (2-6° С). Методика их применения в соответствии с рекомендациями авторов следующая. Испытуемую культуру выращивают 16-18 часов при 37° С, затем засе­вают в МПБ с глюкозой (0,5%). Доза культуры должна быть такой, что­бы после посева среда опалесцировала. Далее подращивают 4 часа при 37° С, высевают газоном на 2%-ный подсушенный МПА в чашках Петри, выдерживают в термостате при 37° С в течение 1-1,5 часов (крышка дол­жна быть слегка приоткрытой).

Таблица 47 - Дифференцирующие признаки видов рода Listeria

Примечание к таблице 47

Пробел означает, что признак не исследован. Вид L. denitrificans перенесен в отдельный род Yonesia. ¹⁾ Обычно широкая зона или многочисленные зоны. ²⁾ Некоторые штаммы отрицательные. Обозначения: «d» — 11-80% штаммов положительные.

Далее на газон с культурой бактериологической петлей наносят раз­дельно по одной капле бактериофагов и каплю стерильного бульона (контроль), отмечая карандашом зону каждого фага и контроля. Рас­стояние между каплями должно быть не менее 1 см. Посевы инкубиру­ют при 22-23° С в течение 16-24 часов. В положительном случае на месте нанесения фага образуется прозрачная зона лизиса. Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста (вторичная культура) при интенсивном росте культуры на остальной площади пи­тательной среды. Для достоверности результатов целесообразно про­водить 2-3 параллельных исследования. Нелизируемые культуры иден­тифицируют по общим критериям.

Для обнаружения L. monocytogenes также рекомендуется реакция на­растания титра фага (РНФ).

Серологическая идентификация листерий. Идентификация листерий в РА. Листерий имеют О- и Н-антигены, ко­торые могут встречаться в различных комбинациях. Известно не менее 16 сероваров L. monocytogenes, но большая часть случаев заболеваний связа­на с сероварами 48, 1/2а, 1/2в. Антигенная структура листерий представлена в таблице.

Распределение серотипов по видам рода Listeria следующее: L.monocytogenes — 1/2А, 1/2В, 1/2С, 3А, 3В, 3С, 4А, 4АВ, 4С, 4D, 4F, «7»; L. ivanovii -5; L. innocua -4AB, 6А, 6В; L. weishimeri -6A, 6B;
L. seeligeri -l/2B, 4С, 4D, 6В. Как видно, L. monocytogenes имеет одну или несколько антигенных детерминант, общих с другими видами листерий. В РФ диагностические лаборатории используют листериозные агглюти­нирующие сыворотки. Поливалентная сыворотка содержит антитела против антигенов Н — АВ и О — II, V, VI, VII, IX и агглютинирует все известные серовары листерий. Типовые сыворотки позволяют иденти­фицировать листерий 1-го серотипа, которые содержат антигены О — II, и 2-го серотипа, имеющего О-антигены V и VI. Серологическую идентификацию проводят в РА на стекле.

Идентифицируемую культуру выращивают на МПБ при 37° С в тече­ние 24 часов, затем засевают на две пробирки скошенного МПА, выращи­вают при 18-20° С в течение 24-30 часов, смывают стерильным физиоло­гическим раствором и устанавливают концентрацию приблизительно 10-15 млрд микробных клеток в 1 мл.

На первом этапе приготовленный антиген исследуют в РА на стекле с поливалентной сывороткой, смешивая каплю сыворотки и каплю антиге­на, сыворотки и физиологического раствора (контроль). Учет проводят в течение трех минут. При наличии спонтанной агглютинации антигена в контроле опыт повторяют с применением в качестве антигена 24-часовой бульонной культуры, выращенной при комнатной температуре. Для даль­нейшего исследования берут культуры, давшие положительную РА, идентифицированные как листерии.

Таблица 48 - Антигенная структура L. monocytogenes,