Работа 4. Определение концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови биуретовым методом (набор НТК «Анализ-Х») - УИРС

Значение концентрации общего белка в сыворотке крови практически здоровых людей составляют: у взрослых 65-85 г/л, у детей до 6 лет - 56-85 г/л, у новорожденных - 53-89 г/л. Из колориметрических методов количественного определения белка особого внимания заслуживает биуретовый метод, основанный на биуретовой реакции. Принцип: в щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексы фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания в определенных пределах пропорциональна концентрации белка. Содержание белка устанавливается по интенсивности светопоглощения при 540-560 нм фотометрически. Для расчета количества белка в исследуемом растворе необходимо пользоваться калибровочным графиком, построенным по стандартным растворам белка.

Состав набора

1. Биуретовый реактив (3 флакона по 3,5 г). Приготовление раствора биуретового реактива: содержимое одного флакона растворить в 250 мл дистиллированной воды. Раствор хранится в холодильнике 7 суток.

2. Стандарт белка (раствор или лиофилизат).

3. В лаборатории биуретовый реактив можно приготовить по прописи: растворить 0,15 г CuSO₄×5Н₂О и 0,6г NaKC₄Н₄О₆×4Н₂О (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) в 50 мл воды при энергичном перемешивании, добавляют 30 мл 10% раствора NaOH и 0,1 г KJ и доводят раствор до объема 100 мл.

Ход работы

В пробирки помещают 0,05 мл сыворотки крови и 2,5 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают, избегая образования пены. Через 30 мин измеряют оптическую плотность на КФК в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят также, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,05 мл физиологического раствора. Расчет ведут по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора белка, как указано в таблице:

А - концентрация стандартного раствора белка, указанная на флаконе.

Из каждого разведения необходимо взять по 0,05 мл о обработать как пробу. Через 30-60 мин измеряют оптическую плотность против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график. Вычисляют факторы пересчета делением концентраций стандартных растворов на экстинкцию (оптическую плотность). Выводят средний фактор (F). Расчет ведут по формуле: Соп.=Еоп.´F, где Соп – концентрация белка в пробе, F – усредненный фактор. При содержании белка в сыворотке больше 100 г/л, сыворотку разводят физиологическим раствором, а результат умножают на разведение. Этот метод не используют для определения количества белка в моче или спинномозговой жидкости.