Биотехнологические основы культивирования микроорганизмов. 5 page

- удаляя гены, ответственные за вирулентность (вызывание заболевания), получают эффективные живые вакцины, лишенные осложнений;

- клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного (болезнетворного) микроорганизма, встраивают в непатогенный носитель (чаще вирус) и получают безопасную вакцину;

- гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в экспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют как вакцину;

- пептидные вакцины получают с помощью методик химического синтеза пептидов.

Биотехнология и растениеводство. Скорость роста и урожайность растений в естественных условиях зависят от их генотипа, доступности питательных веществ, наличия в почве полезных микроорганизмов и отсутствия патогенных. Создание штаммов микроорганизмов, усиливающих рост растений включает четыре основных направления:

- оптимизация молекулярных механизмов фиксации азота, чтобы уменьшить количество вносимых удобрений;

- усиление образования корневых клубеньков симбиотическими бактериями;

- обеспечение микробиологического синтеза веществ, хелатирующих железо (сидерофоров) с целью подавления роста фитопатогенов;

- микробиологический синтез фитогормонов для усиления роста растений.

В настоящее время в сельском хозяйстве используют бактерии семейств Rhizobium и Bradyrhizobium, которые вступают в симбиотические отношения со строго определенными растениями. Молекулярно-генетические исследования показали, что фиксация азота бактериями – это сложный процесс, в котором участвует семь координировано регулируемых оперонов, кодирующих в общей сложности 20 разных белков. Такая сложная система пока не может быть введена в растение, чтобы оно само без помощи азотфиксирующих бактерий утилизировало азот. Вступая в симбиотические отношения с растениями, штаммы Rhizobium стимулируют образование на их корнях клубеньков, где и происходит размножение этих бактерий и фиксация азота. Процесс образования клубеньков требует функционирования продуктов экспрессии множества генов и также пока не имеет реальных генно-инженерных подходов для оптимизации (конкуренции с менее эффективными дикими штаммами).

Опосредованная стимуляция роста растений с помощью бактерий состоит в защите растений от их повреждения фитопатогенными грибами и бактериями. Такие защитные бактерии синтезируют специфические вещества, стимулирующие рост растений: сидерофоры, антибиотики, ферменты, фитогормоны.

Микробные инсектициды. Известно, что число описанных видов насекомых приближается к 1 млн. Некоторые насекомые являются переносчиками заболеваний человека и животных, а также могут наносить ущерб урожаю сельскохозяйственных культур. Химические инсектициды (хлорорганические – дихлордифенилтрихлорэтан, ДДТ и фосфорорганические – малатион, паратион, диазинон) оказывают вредное влияние на человека, а ДДТ может накапливаться и сохраняться до 20 лет, нанося ущерб живым организмам окружающей среды. Под «микробным инсектицидом» понимают микроорганизм синтезирующий токсическое вещество для подавления жизнедеятельности определенных насекомых или инфицирующий насекомое-мишень и приводящий к его гибели. Микробные инсектициды не оказывают вредного влияния на окружающую среду, но помогают регулировать численность насекомых. Рассмотрим некоторые примеры микробных инсектицидов:

- некоторые подвиды бактерии B. thuringiensis образуют протоксин, который в условиях щелочной среды кишечника насекомых и под действием пищеварительных протеиназ превращается в убивающий насекомое активный токсин;

- для расширения видов насекомых-мишеней, были созданы рекомбинантные бактерии, несущие гены нескольких токсинов B. thuringiensis;

- гены токсинов B. thuringiensis вводили в микроорганизмы, обитающие в поверхностном слое воды и служащие пищей для личинок комаров; аналогичный подход был использован для борьбы с насекомыми, повреждающими корни растений;

- бакуловирусы, патогенные для небольшого числа насекомых, были трансформированы путем введения генов, обеспечивающих синтез инсектицида в течение всего жизненного цикла вируса или синтеза смертельных для насекомых нейротоксинов.

Таким образом, технология рекомбинантных ДНК позволяет получить новые продукты имеющие прямую коммерческую ценность (тесты, лекарства, вакцины, низкомолекулярные биорегуляторы, белки) и опосредованную путем совершенствования технологических процессов очищения внешней среды и повышения эффективности сельского хозяйства.

Трансгенные растения. Получение высокоурожайных растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды остается актуальной научно-практической задачей. Эта задача решается с помощью традиционных селекционных подходов (длительный процесс, 10-15 лет) и новых технологий генетической инженерии (результат за 3-5 лет). В настоящее время разработано несколько эффективных систем переноса ДНК и экспрессирующих векторов, которые работают в растительных клетках. Одним из достоинств растительных клеток является их тотипотентность: из одной клетки может быть регенерировано целое растение. Из клеток, сконструированных генноинженерными методами, можно получить фертильные растения, все клетки которых несут чужеродный(е) ген(ы) – трансгенные растения. Если такое растение цветет и дает семена, то введенная генетическая информация будет передаваться по наследству, т.е. следующим поколениям растения.

Трансгенные растения, не содержащие маркерные гены. Обычно при введении чужеродного гена, кодирующего желаемый признак, в растение одновременно вводится и селективный маркерный ген. Продукты экспрессии маркерных генов служат для отбора клеток с желаемыми свойствами, например, по их чувствительности к антибиотикам. Выполнив свою вспомогательную роль по трансформации растительной клетки, селективные маркерные гены способны вызывать негативные эффекты:

- белки-продукты их экспрессии могут оказаться аллергенами или токсинами;

- гены устойчивости к антибиотикам могут попасть в патогенные почвенные микроорганизмы;

- один селективный маркерный ген не используется дважды, поэтому его присутствие может затруднить трансформацию трансгенных растений дополнительными генами.

В связи с этим были предложены методы удаления маркерных генов из трансгенных растений. Например, получение безмаркерных трансгенных растений включает котрансформацию растений двумя разными ДНК, одна из которых несет маркерный ген, а другая – вводимый ген желаемого признака. В этом случае 30-80% растений содержат оба гена, которые введены в разные участки хромосомной ДНК. После отбора трансформированных растений с помощью продуктов экспрессии маркерного гена, его удаляют из трансгенного растения путем обычного скрещивания.

Устойчивость к насекомым-вредителям. В конце прошлого века в мире было израсходовано более 4 млрд. долларов на использование химических инсектицидов. Их многократное применение (опрыскивание) в течение вегетационного периода требует технических устройств и отвлечения людей. Поэтому целесообразно создание растений (например, злаковых), способных продуцировать функциональные инсектициды. Для создания растений, устойчивых к насекомым-вредителям, с помощью генноинженерных методов были разработаны различные технологии.

Один из популярных подходов базируется на использовании гена инсектицидного протоксина, продуцируемого B. thuringiensis (микробный инсектицид). Инсектицид (токсин белковой природы) находится в клетке в виде так называемого параспорального кристалла – структуры, которая образуется во время споруляции бактерий. На его долю приходится 20-30% сухой массы спорулирующей культуры (95% - белок, 5% - углеводы). Кристалл – это четвертичная структура белка, диссоциирующая на субъединицы при щелочном значении рН. Выделяют 4 основных класса токсина: CryI – токсичен для чешуекрылых, CryII - для чешуекрылых и двукрылых, CryIII – для жесткокрылых, CryIV – для двукрылых, которые разделяются на подклассы и подгруппы. В параспоральном кристалле инсектицид неактивен; при солюбилизации кристалла белок высвобождается в форме протоксина, предшественника активного токсина. Молекулярная масса протоксина CryI около 130 кДа. После заглатывания насекомым параспорального кристалла протоксин активируется в кишечнике в условиях щелочного рН (7,5-8,0) и под действием пищеварительных протеиназ превращается в активный токсин с молекулярной массой 68 кДа. Этот токсин встраивается в мембрану эпителиальных клеток кишечника и образует канал, через который утрачивается часть АТФ и других компонентов клетки. Насекомое перестает питаться, обезвоживается и погибает. Для создания трансгенных растений, которым введен ген токсина B. thuringiensis было использовано несколько приемов.

1. Был введен ген N-концевой части молекулы токсина (отвечает за токсичность) и вместе с сильным растительным промотором (для повышения экспрессии гена); количество синтезированного растением токсина увеличилось и была достигнута некоторая защита от насекомых (трансгенный томат). Эффективность такого подхода была недостаточной из-за того, что в переносимом гене присутствовали нуклеотидные последовательности, характерные для бактерий и замедляющие экспрессию гена в растительных клетках.

2. С помощью сайт-специфического мутагенеза, а также химического мутагенеза были получены измененные гены токсина, клонирование которых в растительных клетках увеличило продукцию токсина в 100 раз. В США проведены успешные испытания и дано разрешение на использование инсектицидного токсина B. thuringiensis для повышения устойчивости картофеля к колорадскому жуку. Следует помнить, однако, о необходимости постоянного контроля популяции насекомых-вредителей, с тем чтобы вовремя обнаружить устойчивые организмы. В настоящее ведутся работы по введению бактериального гена холестеролоксидазы в хлопчатник для борьбы с личинками хлопкового долгоносика (фермент разрушает эпителиальные клетки средней кишки насекомого).

3. Были проведены эксперименты, которые показали возможность индукции синтеза протоксина путем обработки трансгенного растения недорогим и безопасным химическим веществом (например, салициловой или полиакриловой кислотой) в определенный момент вегетационного периода. Такая периодичность синтеза позволяет замедлить развитие устойчивости у насекомых к микробному инсектициду, продуцируемому растением. Аналогичные системы могут оказаться полезными для регуляции синтеза самых разных чужеродных белков в трансгенных растениях.

Другой подход базируется на том, что некоторые растения синтезируют ингибиторы протеиназ, которые, попадая в кишечник насекомого, блокируют гидролиз растительных белков. Возникло предположение о введении растительного гена ингибитора протеиназ с сильным растительным промотором в растительные клетки. Например, был клонирован ген, кодирующий ингибитор трипсина вигны китайской, в табак. Оказалось, что ущерб, наносимый личинками совки (Heliothis virescens) трансгенным растениям, синтезирующим более 2 мкг ингибитора трипсина на 1 мг растительного белка, был значительно меньше, чем в случае обычных растений. Введение гена ингибитора II протеиназы картофеля в растения риса защищает их от розового стеблевого точильщика (Sesamia inferens), основного насекомого-вредителя для этой культуры; заражение приводит к образованию полых стеблей и мертвых метелок без семян. Поскольку растительные ингибиторы протеиназ являются обычными компонентами рациона человека и животных и в процессе приготовления пищи быстро инактивируются, их введение в новые зерновые культуры можно считать безопасным.

Третий подход сформировался на основу двух предыдущих: использование токсина B. thuringiensis и ингибитора протеиназ сериновой природы. Оказалось, что смесь очищенного токсина B. thuringiensis в количестве, обеспечивающем минимальную смертность насекомых, и ингибитора протеиназ в низких концентрациях обладает в 20 раз большей инсектицидной активностью, чем один протоксин B. thuringiensis.

Четвертый подход предполагает введение в растительные клетки гена, кодирующего ингибитор альфа-амилазы. Большой ущерб зерновым наносят зерновка (Callosobruchus maculates) и долгоносик лучистой фасоли (C. Chinensis). Если питать этих насекомых обычной фасолью (Phaseolus vulgaris), то они погибают из-за присутствия в ней ингибитора альфа-амилазы, а следовательно подавления гидролиза крахмала – основного продукта питания насекомых. Был выделен ген этого ингибитора и клонирован в растение, весьма чувствительное к насекомым, горох (Pisum sativum). В результате были получены растения трансгенного гороха, устойчивые к обоим насекомым.

Устойчивость к вирусам. Вирусы растений существенно снижают урожай. Чтобы не прибегать к обработке культур химическими препаратами, селекционеры попытались перенести природные гены устойчивости к вирусам от одной линии растений к другой. Однако устойчивость растений быстро утрачивалась. Природный иммунитет к вирусным инфекциям обусловливается разными причинами:

- блокированием проникновения вируса в растение;

- предотвращение распространения вируса в здоровые клетки;

- подавление симптомов вирусной инфекции.

Чтобы получить растения, устойчивые к вирусам, проводили их «иммунизацию» вирусными генами, кодирующими белки оболочки, другими вирусными генами или антисмысловыми последовательностями вирусного генома. Обнадеживающие результаты были получены, если в трансгенном растении экспрессируется ген, кодирующий белок оболочки вируса: создано множество трансгенных зерновых и других растений. Механизм подавления пролиферации вирусных частиц в присутствии произведенного растением белка оболочки вируса пока неясен. Ценность подхода увеличивается в связи с тем, что ген белка оболочки одного вируса иногда обеспечивает устойчивость к широкому кругу неродственных вирусов.

Защита растений от патогенных вирусов может осуществляться естественными противовирусными белками, синтезируемыми самими растениями. Например, в клеточной стенке фитолакки американской (Phytolacca americana) присутствуют три разных противовирусных белка: РАР, синтезируемый в листьях весной, РАРII, обнаруживаемый в листьях летом, и РАР-S, содержащийся в семенах. Эти белки легко выделить из водных экстрактов измельченных тканей растения. Если небольшое количество РАР нанести на листья других растений, то последние также окажутся устойчивыми к нескольким вирусам. Ген РАР был использован для получения трансгенных растений, устойчивых к широкому спектру вирусов растений.

Устойчивость к гербицидам. Известно, что почти 10% урожая теряется из-за сорняков. Для борьбы с сорняками используется около 100 химических гербицидов, на производство которых в мире тратится 10 млрд долларов США. В присутствии гербицидов сельскохозяйственные растения не должны терять продуктивность. Для этого их необходимо генетически трансформировать, чтобы:

- уменьшить поглощение гербицида культурным растением;

- уменьшить способность белка, чувствительного к гербициду, к связыванию с ним;

- обеспечить синтез белка, чувствительного к гербициду в таком количестве, чтобы его хватало на выполнение присущих ему функций в присутствии гербицида;

- обеспечить инактивацию гербицида в ходе метаболизма культурного растения.

Были получены растения, устойчивые к глифосфату – гербициду, быстро разлагающемуся в почве на нетоксические составляющие и потому безопасному для окружающей среды. Глифосфат является ингибитором 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS) – фермента, играющего важную роль в синтезе ароматических аминокислот и у бактерий, и у растений. Из глифосфатустойчивого штамма E.coli был выделен ген, кодирующий EPSPS, помещен под контроль растительного промотора и введен в растительные клетки. Трансгенные растения табака, петуньи, томата, картофеля и хлопка, синтезировавшие EPSPS в количестве, достаточном для замены ингибированного гербицидом растительного фермента, были устойчивы к глифосфату и при обработке, в отличие от сорняков, не погибали.

Устойчивость к грибам и бактериям. Фитопатогенные грибы наносят ощутимый ущерб сельскохозяйственной продукции. Например, в странах, где выращивается рис, ущерб от гриба, вызывающего пирикуляриоз риса, оценивается в 5 млрд. долларов. Выведены растения, устойчивые к болезнетворным грибам, за счет переноса и экспрессии генов PR-белков (pathogenesis-related proteins) – β-1,3-глюканаза, хитиназа, тауматинподобные белки, ингибиторы протеиназ. Все эти белки подавляют жизнедеятельность патогенных грибов.

Ущерб, наносимый урожаю картофеля почвенной бактерией Erwinia carotovora, составляет до 100 млн. долларов в год. Химических способов защиты от этого патогена не существует. Поэтому было создано трансгенное растение картофеля, способное экспрессировать ген лизоцима бактериофага Т4. Лизоцим секретировался в апопласт (межклеточное пространство, т.е. в компартмент куда проникают болезнетворные бактерии и лизировал их. Поскольку лизоцим лизирует различные грамположительные и грамотрицательные растения, этот подход перспективен для защиты растений от других патогенных бактерий.

Устойчивость к неблагоприятным воздействиям и старению. Растение не способно активно избегать неблагоприятных факторов внешней среды: высокой освещенности, ультрафиолетового облучения, высоких температур, концентраций солей и др. Для защиты срабатывают эволюционно отобранные механизмы «физиологического стресса». В составе этих реакций присутствуют свободнорадикальные, вызывающие образование радикальных форм кислорода – «окислительный стресс» - супероксидный, гидроксидный, пероксидный радикалы. Для обезвреживания супероксидного радикала служит фермент супероксиддисмутаза. Известно, что Cu/Zn-супероксиддисмутаза содержится в хлоропластах, Mn-супероксиддисмутаза – в митохондриях; некоторые растения синтезируют Fe-супероксиддисмутазу. Созданы трансгенные растения устойчивые к очень яркому свету путем переноса и экспрессии гена Cu/Zn-супероксиддисмутазы: у контрольных растений фотосинтетическая активность утрачивалась, а у трансгенных сохранялась на уровне 94%.

Растения, произрастающие на засоленных почвах, синтезируют нетоксичные вещества – осмопротекторы. Они способствуют поглощению и удержанию воды, а также предотвращают разрушение макромолекул, присутствующих в клетках растений, под действием высоких концентраций солей. Осмопротекторами являются сахара, спирты, пролин и четвертичные соединения аммиака. Одним из высокоактивных осмолитиков является бетаин, который накапливается в некоторых растениях во время засухи или при высокой засоленности почв. Были созданы устойчивые растения путем переноса гена кишечной палочки, кодирующий синтез ферментов бетаинообразования.

Контроль времени созревания плодов. Преждевременное созревание и размягчение плодов затрудняет их транспортировку. Известно, что при созревании плодов в растениях активируются специфические гены, кодирующие ферменты целлюлазу и полигалактуроназу. Если подавить их экспрссию, созревание будет замедляться. Созданы трансгенные растения томата, в которых нарушен синтез полигалактуроназы, плоды которых удобны для транспортировки и с 1994 года разрешены к реализации Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США как безопасные. Другим фактором, ускоряющим созревание плодов, является этилен. Он синтезируется из S-аденозилметионина с образованием промежуточного продукта 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АСС). Созданы трансгенные растения томата, в которых подавлен синтез ААС, а, следовательно, и этилена. Из некоторых почвенных растений был выделен ген ААС-дезаминазы и введен в геном томата. Полученные растения синтезировали меньше этилена, чем нормальные, а их плоды тоже имели гораздо более длительный срок хранения.

Изменение декоративных свойств растений. Примерно 70% объема индустрии цветоводства приходится на долю четырех растений: роз, гвоздик, тюльпанов и хризантем. В окраске цветов важную роль играют флавоноиды - антоцианины. Они синтезируются из фенилаланина. Окраска цветка определяется химическими свойствами флавоноидов, например, цианидина (красный цвет) и дельфинидина (синий цвет). Созданы трансгенные цветковые растения, у которых подавлена или введена новая ферментативная реакция в метаболических цепях превращений антоцианинов, что обеспечило новые коммерчески выгодные варианты формы и окраски цветов.

Трансгенные растения, синтезирующие Mn-супероксиддисмутазу, в 3-4 раза менее чувствительны к действию озона. В перспективе – создание трансгенных цветковых растений, содержащих супероксиддисмутазу, препятствующую увяданию.

Изменение пищевой ценности растений реализуется методами генетической инженерии по следующим направлениям:

- изменение аминокислотного состава запасных белков семян;

- изменение жирнокислотного состава плодов;

- улучшение вкуса фруктов путем введения в растения гена монеллина (растительного белка, имеющего сладкий вкус).

Известно, что запасные белки, которые служат источниками углерода и азота прорастающих семян, состоят из ограниченного повторяющегося набора аминокислот, среди которых отсутствуют некоторые незаменимые аминокислоты. Для повышения биологической ценности запасных белков, например, путем обогащения лизином, был апробирован метод отмены ингибирующего действия лизином своего собственного синтеза. Для этого в растительные клетки были введены регуляторные гены биосинтеза лизина микробного происхождения, которые отличались от растительных тем, что они не чувствительны к ингибирующему действию лизина. В семенах полученных трансгенных растений содержалось в 100 раз больше свободного лизина.

Считают, что спустя 5-7 лет в мире будет выработано растительного масла на сумму 70 млрд. долларов. Около 75% всех масличных культур приходится на долю сои, пальмы, рапса (канолы) и подсолнечника. В получаемых маслах содержатся пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая и линоленовая жирные кислоты. С помощью генетической инженерии созданы десятки сортов рапса, которые синтезировали масла с измененным жирнокислотным составом. Каждый трансгенный сорт содержал один дополнительный ген, который кодировал белки-ферменты, обеспечивающие накопление одной жирной кислоты.

Изменения внешнего вида и вкуса. Изменение цвета овощей и фруктов начинается с окисления монофенолов и о-дифенолов до о-хинонов. Этот процесс катализируют полифенолоксидазы, локализующиеся в мембранах хлоропластов и митохондрий. Начаты исследования по созданию трансгенных растений, окраску которых можно будет контролировать через введение и экспрессию генов полифенолоксидазы.

В плоде африканского растения Dioscorephyllum cumminsii Diels содержится белок монеллин, примерно в 100000 раз более сладкий, чем сахароза в эквимолярных количествах. Ген монеллина был химически синтезирован и введен в растительные клетки инфицированием их A. tumefaciens, используя Ti-плазмиды. Монеллин был обнаружен в зрелых помидорах и листьях салата.

Растения как биореакторы. Для использования рекомбинантных бактерий, производящих белки или низкомолекулярные биорегуляторы, требуются биореакторы и квалифицированный персонал. Создание трансгенных растений для тех же целей менее затратно. В настоящее время имеются экспериментальные установки по получению с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов антител и подверженного биодеградации биополимера поли-β-гидроксибутирата. Рассмотрим этапы создания трансгенного растения, производящего данный биополимер.

1. В бактериях Alcaligenes eutrophus поли-β-гидроксибутират синтезируется из ацетил-КоА в тремя ферментами, гены которых входят в один оперон. Растения могут экспрессировать только один ген.

2. Каждый из генов был клонирован по отдельности и встроен в хлоропластную ДНК растения Arabidopsis thaliana.

3. Два трансгенных растения, каждое со своим чужеродным геном, скрещивали, чтобы получить растения с двумя чужеродными генами, включенными в хлоропластную ДНК.

4. Полученное трансгенное растение с двумя чужеродными генами скрещивали с растением, несущим третий чужеродный ген, и отбирали растения, несущие все три бактериальных гена поли-β-гидроксибутирата. В листьях такого трансгенного растения, экспрессирующего все три бактериальных гена, синтезировалось более 1 мг поли-β-гидроксибутирата на 1 г сырой ткани листа.

К настоящему времени на рынок поступило лишь небольшое число генетически модифицированных растений, в основном соя, однако можно ожидать их стремительное производство в обозримом будущем.

Трансгенные животные. Стратегия скрещивания и отбора, хотя и требует много времени, остается основой выведения новых пород сельскохозяйственных животных, птицы и рыб. Однако после выведения эффективной генетической линии добавление новых признаков без риска утраты создаваемых свойств потребовало новых методических и биотехнологических подходов, в частности, путем переноса ядра из эмбриональной клетки в яйцеклетку с удаленным ядром (перенос ядра, клонирование):

- клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки;

- инокулированные оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в матку самки;

- отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках;

- скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Эта идея реализована на практике в 1980 гг. Были введены новые термины: трансгенное животное (генотип изменен введением чужеродной ДНК), трансген – вводимая ДНК, трансгеноз – процесс создания трансгенного животного.

Трансгенные животные: методология. Ведение чужеродной ДНК животным осуществляют несколькими способами:

1. С помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион («суррогатные» матери), производят на свет трансгенное потомство.

2. Микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки. У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. Это лежит в основе метода получения линий трансгенных животных методом микроинъекций.

- Яйцеклетки выделяют из самок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Гиперовуляция вызывается введением самкам сыворотки беременной кобылы и хорионического гонадотропина человека (увеличивается образование яйцеклеток в 3-7 раз).

- Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки.

- Яйцеклетки имплантируют в «суррогатную» мать, которая производит на свет трансгенное потомство.

3. Введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития. Этот метод получил развитие в экспериментах на мышах. Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриоальными стволовыми клетками (ES). ES-клетки в культуре легко модифицировать методами генетической инженерии без нарушения их плюрипотентности.

- ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши.

- Их трансформируют вектором, несущим трансген, культивируют и идентифицируют трансформированные клетки методом позитивно-негативной селекции или ПЦР.

- Популяцию трансформированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатных» матерей.

- Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных мышей.

4. Клонированием с помощью переноса ядра. Опыты были поставлены на овцах (у этих животных в течение первых трех делений зиготы, занимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК и ни один из генов не экспрессируется). Клонирование овечки Долли из ядра дифференцированной клетки осуществляли следующим образом.

- Ядро яйцеклетки удаляли с помощью микропипетки.

- Культивировали эпителиальные клетки молочной железы (дифференцированные клетки) взрослой особи и переводили их в фазу клеточного цикла G₀.

- Осуществляли слияние эпителиальных клеток в G₀-фазе и яйцеклеток, лишенных ядра. Получали яйцеклетки с ядрами от эпителиальных клеток.

- Выращивали восстановленные яйцеклетки в культуре или в яйцеводе с наложенной лигатурой до ранних стадий эмбриогенеза.

- Имплантировали яйцеклетки с ядрами эпителиальных клеток молочной железы в матку «суррогатной» матери, где и происходило развитие плода.

Все перечисленные обладают крайне низкой эффективностью и не могут пока найти широкое применение в практике. Так, например, при получении клонированной овечки было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе G₀; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода.

Date: 2015-09-27; view: 647; Нарушение авторских прав