Определение концентрации гемоглобина

Наибольшее развитие получили колориметрические методы определения концентрации гемоглобина, основанные на колориметрии производных гемоглобина. К унифицированным методам относится гемиглобинцианидный метод, при проведении которого гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием. Образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колориметрически.

Пробирку со смесью трансформирующего раствора и крови (см. табл. 1, 2) инкубируют 10 минут. Измеряют на ФЭК при длине волны 500–560 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор). В тех же условиях проводят измерение стандартного раствора.

Расчет содержания гемоглобина проводят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобин­цианида.

Стандартный (калибровочный) раствор гемиглобинцианида изготавливается предприятиями (фирмами), выпускающими химические реактивы для лабораторных исследований, и входит в специальные наборы для определения концентрации гемоглобина. Стандартный раствор имеет известную концентрацию гемиглобинцианида, указанную на упаковке набора. Приготавливая ряд разведений этого раствора гемиглобинцианида и измеряя их оптическую плотность, проводят построение калибровочного графика.

2.2.3. Определение количества клеток крови
путем подсчета в камере Горяева

Камера Горяева является вариантом гемоцитометра, или счетной камеры, и представляет собой специальное стекло, в углублении которого (0,1 мм) нанесена сетка с большими и малыми квадратами строго определенного размера.

Перед работой камеру Горяева тщательно протирают сухой салфеткой и притирают к ее поверхности покровное стекло таким образом, чтобы по его краям появились радужные полосы.

Камеру заполняют суспензией крови и разводящего раствора (см. табл. 1, 2), оставляют на горизонтальной поверхности около 1 минуты для оседания клеток крови и затем микроскопируют на малом увеличении светового микроскопа при опущенном конденсоре и прикрытой диафрагме для лучшего контрастирования клеток.

Определение количества эритроцитов проводят в пяти больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (200), числа подсчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000 мкл), по следующей формуле:

X = (a ´ 4000 ´ 200) / 80 = a ´ 10 000,

где а – количество подсчитанных эритроцитов.

Для определения количества эритроцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 10³ или 10⁶.

Определение количества лейкоцитов проводят в 100 больших квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (20), числа подсчитанных квадратов (100) и объема 1 большого квадрата (1/250 мкл), по следующей формуле:

X = (a ´ 250 ´ 20) / 100 = a ´ 50,

где а – количество подсчитанных лейкоцитов.

Для определения количества лейкоцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 10³ или 10⁶.

Определение количества тромбоцитов проводят в 25 больших квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (200), числа подсчитанных квадратов (25) и объема 1 большого квадрата (1/250 мкл), по следующей формуле:

X = (a ´ 250 ´ 200) / 25 = a ´ 2 000.

Для определения количества тромбоцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 10³ или 10⁶.

3. Автоматические анализаторы
для проведения общего анализа крови

В настоящее время ручные методы определения основных гематологических показателей (число эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, концентрации гемоглобина, оценка морфологии и размеров эритроцитов и др.) вследствие высокой степени субъективизма постепенно выводятся из применения. Такие методы отличаются от автоматических только одним преимуществом – возможностью проведения в любых условиях без специального дорогостоящего оборудования.

Более точными методами определения гематологических показателей являются автоматические. Их развитие прошло более чем 30‑летний путь – от полуавтоматических одноканальных приборов до мульти-параметрических анализаторов, которые определяют более 20 показателей со скоростью 120 проб крови в час.

Все приборы для проведения автоматического гематологического анализа можно разделить на две группы – автоматические счетчики клеток и автоматические анализаторы клеток.

В автоматических счетчиках клеток крови применяются:

* кондуктометрический принцип – определение изменений электрического сопротивления при пропускании суспензии клеток через отверстие малого диаметра (Coulter, Sysmex, Celloscope). Этот тип счетчиков позволяет определять количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, измерять объем клеток, размеры клеток. Результаты могут представляться как в цифровом виде, так и в виде гистограмм распределения. Данные фиксируются в памяти приборов;

* принцип проточной цитометрии позволяет определять концентрацию гемоглобина в каждом эритроците, а затем происходит построение гистограммы распределения клеток не только по объему, но и по концентрации гемоглобина. В этом случае вводится новый показатель, характеризующий гетерогенность пула эритроцитов, – ширина распределения эритроцитов по концентрации гемоглобина.

Автоматические анализаторы клеток дают возможность получить не только количественные и производные от них параметры, но и данные, позволяющие дифференцировать различные популяции и субпопуляции клеток (преимущественно, лейкоцитов). В основном выделяют два типа автоматов:

1) анализ клеточного изображения с дифференцировкой клеток по созданной компьютерной модели распознавания. Эти приборы дают возможность получения визуальной информации и ее сохранения в памяти компьютера;

2) проточные системы, различающие разные клетки по их размерам и особенностям окрашивания. Преимущество этих приборов в высокой производительности и большом количестве возможных параметров (до 36).

В основе работы проточных систем лежат различные методы:

1) кондуктометрический – измерение сопротивления клетки в постоянном электрическом поле;

2) радиочастотный – амплитуда сигналов при прохождении клетки через апертуру зависит от размеров ядра, плотности ядерного матрикса и цитоплазматических включений, т. е. учитываются сигналы, отражающие характер внутренней структуры клетки;

3) регистрация светорассеяния и поглощения – оптические детекторы. Работа оптических детекторов основана на действии лазерного луча, который пропускают через суспензию клеток. При пересечении луча клеткой происходит поглощение и рассеяние света. Различия этих процессов зависят от свойств клеток – размеров, формы, плотности, гранулярности цитоплазматических структур;

4) флюориметрия – измерение флюоресценции красителей, которые избирательно связываются с клеточными структурами. Основное применение метода связано с иммунофенотипированием и анализом содержания ДНК, что позволяет провести диагностику онкогематологических заболеваний, а также исследование иммунной системы;

5) изучение поляризации флюоресценции, которое позволяет оценить текучесть мембран, отражающее функциональное состояние клеток. При поляризации лазерного излучения флюоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет. Разница интенсивности поляризованного света позволяет установить активность вращения молекул клеточной мембраны.

Все эти подходы используются для создания современной диагностической базы, а именно цитометрии. Основными достоинствами автоматических счетчиков и анализаторов клеток являются их быстродействие, которое дает возможности проведения скрининговых исследований, небольшой объем исследуемого материала (крови), значительное число получаемых параметров, часть из которых – расчетные, автоматизированная обработка данных с возможностью сохранения информации и ее наглядного представления.

4. Физиологические уровни
показателей периферической крови

Показатели периферической крови у здоровых людей приведены в табл.4.

Таблица 4. Показатели периферической крови у здоровых людей

Date: 2015-07-02; view: 1064; Нарушение авторских прав