Опишем альтернативный путь активации комплемента микробными клетками

В сыворотке крови всегда имеется небольшой, но значимый уровень спонтанного расщепления C3 белка с образованием C3b и C3a. Из всех белков системы комплемента в сыворотке крови больше всего именно C3: его концентрация в норме составляет 1,2 мг/мл. Компонент C3b способен ковалентно связываться с поверхностными молекулами не всех, но некоторых микроорганизмов. Для C3b есть Рц на фагоцитах, и C3b, таким образом, является самым «энергичным» опсонином в системе комплемента.

Кроме того, связанный с поверхностью микробных клеток C3b активирует другие компоненты системы следующим образом: C3b связывает фактор В (который, кстати, структурно и функционально гомологичен белку C2). Будучи связанным, фактор В становится субстратом для сывороточной сериновой протеазы — фактора D. Протеаза расщепляет белок В на фрагменты Ва и Bb. Bb в свою очередь является активной протеазой. Bb остаётся связанным с C3b на поверхности микроба, образуя активный комплекс C3b/Bb, который по функциональной активности есть C3–конвертаза — самая значимая при альтернативном пути активации системы комплемента. Комплекс C3b/Bb является структурным и функциональным гомологом главной C3–конвертазы классического пути — C4b/C2b. Гены гомологичных белков C2 и фактора В локализованы рядом в области MHC–III. В сыворотке крови млекопитающих есть белок, стабилизирующий комплекс C3b/Bb — это пропердин, или фактор Р.

В результате нарабатывается много C3b: одна единица C3–конвертазы «высаживает» на поверхность микробной клетки около 1000 молекул C3b, который выполняет противомикробную работу. Кроме названной выше опсонизации для фагоцитоза, комплекс C3b/Bb является активной C5–конвертазой, т.е. расщепляет C5 до фрагментов C5a и C5b. Малые фрагменты C5a (самый сильный) и C3a служат медиаторами воспалительной реакции, т.е. создают условия для экстравазации из сосудов в очаг жидкости и клеток крови. Эти компоненты называют анафилатоксинами комплемента. Для них существуют специальные Рц, по крайней мере на тучных клетках (выбрасывающих в качестве реакции содержимое своих гранул) и на гладких мышцах (реагирующих сокращением). C5a действует также прямо на нейтрофилы и моноциты (т.е. фагоциты), повышая их адгезию к стенке кровеносного сосуда, их экстравазацию и фагоцитарную активность. Кроме того, C5a вызывает повышение экспрессии на фагоцитах Рц CR1 и CR3.

С C5b начинаются реакции белков комплемента C6, C7, C8 и C9, коллективно получивших название «мембраноатакующий комплекс», посколько эти реакции завершаются формированием неспадающихся пор в мембране микробных клеток (перфорацией мембраны) и, как следствие, лизисом микробных клеток. Одна молекула C5b связывает одну молекулу C6. Образовавшийся комплекс C5b/C6 присоединяет одну молекулу C7. У молекулы C7 есть гидрофобный домен, через который весь комплекс C5b/C6/C7 встраивается в фосфолипидный бислой мембраны микробной клетки. К этому комплексу своими гидрофобными доменами пристраиваются белки C8 и C9. C8 — комплекс двух белков: C8b присоединяется к C5b, а C8ag встраивается в фосфолипидный бислой. Будучи встроенным, C8ag катализирует полимеризацию 10–16 молекул C9. Данный полимер и формирует неспадающуюся пору в мембране диаметром около 10 нм.

В реальной защите от инфекций этот, казалось бы, мощный деструктивный механизм имеет ограниченные возможности. При генетических дефектах в компонентах C5–C9 единственный фенотипический дефект в противомикробной защите у человека — повышенная восприимчивость к инфекции Neisseria spp, вызывающей такие заболевания, как гонорея и бактериальный менингит.

Классический путь активации комплемента инициируется комплексами Аг–АТ. На молекулах IgM, IgG3 и в меньшей мере IgG1 есть специальные реакционно–способные места, которые после формирования комплекса Аг–АТ способны связывать компонент C1 комплемента, а именно субкомпонент C1q. Молекула C1 состоит из 8 СЕ, 6 из которых одинаковые: C1q (имеющий глобулярную головку и коллагеноподобный хвост), по одной C1r и C1s. Реакция связывания C1q с иммуноглобулинами не происходит в растворе, но требует концентрации на твёрдой фазе — на поверхности микробных клеток. Каждая головка C1q вступает в связь с одним Fc–участком молекулы иммуноглобулина. Активация молекулы C1 требует связывания более двух головок C1q. Ферментом (протеаза) является C1r. Будучи активированной, C1r отщепляет C1s, которая является активной сериновой протеазой. Протеаза C1s расщепляет компоненты системы — сначала C4, C2. C4b способен ковалентно связываться с поверхностью микробных клеток (важно, что не собственных эукариотических клеток) и там присоединять к себе C2. Здесь C2 расщепляется той же протеазой C1s. Большие фрагменты C4b и C2b объединяются и становятся главной C3–конвертазой классического пути — комплексом C4b/C2b. В этом комплексе протеазной активностью обладает C2b. C3–конвертаза нарабатывает большие количества C3b. Дальнейшие процессы по механизму совпадают с процессами альтернативного пути активации системы комплемента. Кстати, классический и альтернативный пути активации действуют параллельно, более того, амплифицируя (усиливая) друг друга, а не «или, или».

Рассмотрим Рц для компонентов комплемента на клетках (CR — complement receptors) организма и их функциональные роли. Известно 5 типов CR (табл. 3.4).

CR1, экспрессированный на фагоцитах (макрофагах, нейтрофилах), связывает C3b. Однако только одно это связывание не стимулирует фагоцитоз, но оказывает пермиссивное действие при наличии других стимулов к фагоцитозу — связывание комплексов Аг–АТ через Fcg–Рц или стимуляций g–ИФН (продуктом иммунных T–лимфоцитов).

Таблица 3.4. Клеточные рецепторы для компонентов комплемента

CR1 есть на эритроцитах. После многих инфекций в крови накапливается немало растворимых иммунных комплексов. Их пребывание в циркуляции неблагоприятно для стенок сосудов. Активные компоненты комплемента C4b и C3b ковалентно связывают растворимые иммунные комплексы и через CR1 привязывают их к эритроцитам, которые уносят их с собой к макрофагам селезёнки и печени, обеспечивая тем самым клиренс крови от иммунных комплексов. При этом макрофаг «снимает» иммунный комплекс с эритроцита, не повреждая сам эритроцит. Если этот механизм клиренса крови от иммунных комплексов оказывается недостаточным, то «неубранные» комплексы выпадают в осадок. Этот процесс особенно заметен в базальных мембранах сосудов клубочков почек (CR1 есть и на подоцитах клубочков почек), где он вызывает патологический синдром гломерулонефрита.

C5a–Рц состоит из 7 доменов, пенетрирующих мембрану клетки. Такая структура характерна для Рц, ассоциированных с так называемыми G–белками (белками, способными связывать гуаниновые нуклеотиды).

CR2, CR3 и CR4 связывают C3bi — инактивированную форму C3b, которая остаётся связанной с поверхностью микробной клетки и служит, таким образом, в качестве опсонина. Более того, в отличие от связывания активной формы C3b с CR1 само по себе связывание C3bi с CR3 достаточно для стимуляции фагоцитоза.

Ещё один продукт деградации C3b—C3dg связывается только с CR2. Рц CR2 является существенным корецептором B–лимфоцита. CR2 связывает C3bi и/или C3dg, и это связывание увеличивает в 100–10 тыс. раз восприимчивость B–лимфоцита к своему Аг. К сожалению, эту же мембранную молекулу — CR2 — выбрал в качестве своего Рц вирус Эпштейна–Барр (EBV) — возбудитель инфекционного мононуклеоза.

У людей с генетическими дефектами в C3 или молекулах, обеспечивающих выпадение C3b на поверхности микробных клеток, клинически имеется уязвимость ко многим внеклеточным бактериальным инфекциям.

Собственные клетки организма защищены от деструктивных воздействий активного комплемента благодаря так называемым регуляторным белкам системы комплемента. Часть этих белков — мембранные (табл. 3.5), часть — сывороточные. Один из сывороточных регуляторов — C1–ингибитор (Clinh). Он связывает активный ферментный комплекс C1r/C1s, отрывает его от C1q, который остаётся связанным с Fc–фрагментом АТ на поверхности микробной клетки. Тем самым Clinh ограничивает время, в течение которого C1s катализирует активационное расщепление C4 и C2. Кроме того, Clinh ограничивает спонтанную активацию C1 в плазме крови. При генетическом дефекте Clinh у человека имеется заболевание, называемое наследственным ангионевротическим отёком. Патогенез заболевания состоит в хронически повышенной спонтанной активации системы комплемента. Избыточное накопление, в том числе фрагментов C2a, приводит к повышенному образованию пептида-деривата C2a—C2–кинина. Этот кинин, а также избыточно образующийся брадикинин (тот же ингибитор Clinh регулирует и другие протеазы плазмы) вызывают отёки. Заболевание полностью излечивается заместительной терапией препаратом Clinh.

Таблица 3.5. Мембранные молекулы — регуляторы активности компонентов комплемента

C2b инактивируется двумя белками: сывороточным C4–связывающим белком — C4BP (C4–Binding Protein) и мембранным белком DAF (Decay–Accelerating Factor — фактор, ускоряющий деградацию). Оба эти ингибитора конкурируют с C2b за связывание с C4b. В комплексе с C4BP C4b становится высокочувствительным к деградации с участием сывороточной протеазы (фактора I), расщепляющей C4b на C4c и C4d. Подобным образом два других регуляторных белка: сывороточный фактор H и мембранный CR1 — «поступают» с C3b: они вытесняют собой C2b из комплекса с C3b, делая тем самым C3b доступным для деградации фактором I. Фактор H имеет также химическое сродство для связывания с сиаловыми кислотами, которых много на поверхности клеток млекопитающих, но которых не бывает у большинства бактерий.

Ещё один регуляторный мембранный белок MCP связывает C3b и делает его доступным для деградации фактором I.

У всех регуляторных белков системы комплемента, связывающих C4b и C3b, в первичной последовательности АК присутствуют общие (консенсусные) короткие повторы, характерные именно для комплементконтролируюших белков.

Активность белков комплекса атаки на мембрану также сдерживается мембранными белками собственных клеток CD59 и DAF. Оба они связаны с мембраной клетки через фосфатидил-инозитол-гликолипид. Существует наследственное заболевание человека с дефектом именно в формировании такой фосфатидил–инозитол–гликолипидной связи — пароксизмалъная ночная гемоглобинурия. У таких больных эпизодически возникают приступы внутрисосудистого лизиса собственных эритроцитов активированным комплементом и соответственно происходит экскреция гемоглобина почками.

Лектиновый путь активации комплемента начинается со связывания с углеводами поверхностных структур микробных клеток, а именно с остатками маннозы, такого нормального белка сыворотки крови как связывающий маннозу лектин — СМЛ. У млекопитающих имеется специальная СМЛ–ассоциированная сериновая протеаза, которая аналогично C1s классического пути катализирует активационное расщепление C4. Дальнейшие реакции лектинового пути активации те же, что и при активации по классическому пути.

3.3. Белки острой фазы (C–реактивный белок, связывающий маннозу лектин, сурфактанты)

Белками острой фазы называют несколько белков сыворотки крови, концентрация которых значительно возрастает при патологических процессах, затрагивающих организм в целом. К белкам острой фазы относят фибриноген, СРБ, связывающий маннозу лектин (СМЛ), сурфактанты SP–A и SP–D, у грызунов — ещё сывороточный амилоид. Главное анатомическое место синтеза белков острой фазы — печень. Биохимическим сигналом для повышенного синтеза белков острой фазы служит появление в системной циркуляции цитокинов доиммунного воспаления — ИЛ–6 и опосредованно — TNFa и ИЛ–1, что бывает при тяжёлых системных воспалительных процессах.

Значительные количества этих белков появляются в крови в течение первых 2 дней развития острого процесса, когда специфических АТ ещё нет, последние смогут возникнуть лишь спустя 5–7 дней. В этот ранний период СРБ и СМЛ связывают широкий спектр микробов и опсонизируют их для фагоцитоза и/или лизиса с участием комплемента, т.е. СРБ и СМЛ являются растворимыми Рц — PRR, распознающими патогенов во внутренней среде.

Название «C–реактивный белок» (СРБ) происходит из наблюдения, что этот белок связывает стафилококки группы С. Со временем накопились сведения о том, что СРБ способен связывать в силу своих биохимических свойств ряд бактерий и «отправлять» их на «съедение» фагоцитам. Такое явление, когда связывание микроба в комплекс с неким растворимым белком обеспечивает возможность поглощения этого микроба клеткой–фагоцитом, называют опсонизацией (от лат. opsonen — делающий вкусным). Растворимые белки, способные одной своей стороной связать микроб, а второй стороной — специальный Рц (к себе) на клетке–фагоците, называют опсонинами. У млекопитающих в сыворотке крови известно несколько различных по биохимической природе опсонинов: это СРБ, СМЛ, компонент комплемента C3 и самые многочисленные по разнообразию связываемых микробов иммуноглобулины — АТ — продукты биосинтеза B–лимфоцитов.

СРБ относят к семейству пентраксинов. Пентраксинами называют белки, молекула которых сформирована из 5 одинаковых СЕ. СРБ имеет химическое сродство к фосфорилхолину. Последний входит в состав клеточных стенок ряда бактерий и одноклеточных грибов. По этой причине СРБ способен связывать соответствующие микробные клетки. Фосфорилхолин, входящий в состав фосфолипидов мембран клеток млекопитающих, находится в такой форме, с которой СРБ не связывается. Связав бактерии, СРБ осуществляет два действия: первое — опсонизирует бактерии для фагоцитоза, и второе — активирует каскад комплемента, так как связывает надлежащим образом компонент C1q — первый инициирующий компонент классического пути активации комплемента. Таким образом, не будучи иммуноглобулином, по разрушающим микроб эффекторным механизмам СРБ действует отчасти аналогично АТ, только в отличие от АТ этот белок не вариабелен и способен связывать широкое, но ограниченное множество патогенов. СРБ связывает молекулу C1q за иное место, чем иммуноглобулины: СРБ — за коллагеноподобную часть молекулы, иммуноглобулины — за глобулярные структуры молекулы C1q. Но каскад комплемента запускается тот же самый.

Связывающий маннозу лектин (СМЛ) — кальцийзависимый сахарсвязывающий белок (лектинами по определению называют именно белки, способные с высокой аффинностью связывать углеводы). СМЛ относят к семейству коллектинов. СМЛ связывает остатки маннозы, которые экспонированы на поверхности многих микробных клеток, но экранированы, если присутствуют, в поверхностных углеводах клеток млекопитающих. СМЛ опсонизирует микробные клетки для фагоцитоза моноцитами, которые в отличие от более зрелых макрофагов ещё не экспрессируют собственный Рц для маннозы. Как ни странно, не имея гомологии в АК–последовательности, по вторичной структуре СМЛ похож на C1q. Похож он на C1q и по функции, а именно, связав микробную клетку, СМЛ приобретает способность активировать протеазы, производящие активационное расщепление C4 и C2, что инициирует каскад комплемента. Это и называют лектиновым путём активации системы комплемента.

Помимо СМЛ, к семейству коллектинов принадлежат также белки сурфактанта лёгких — SP–A и SP–D (surfactant proteins A, D). Эти белки, вероятно, имеют существенное значение в опсонизации такого лёгочного патогена как одноклеточный гриб Pneumocystis carinii.