Лабораторная работа. 1. Определение общего холестерина крови методом Илька Оборудование: 1. Штатив с пробирками. 2. Пипетки на 2 мл и 0,1

1. Определение общего холестерина крови методом Илька

Принцип метода. Холестерин в присутствии смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (реактив Илька) переходит в соединение зеленого цвета. Реакция происходит в темноте. Интенсивность окраски измеряют колориметрически.

Ход работы. Для проведения реакции Илька берут сухие пробирки. В одну пробирку к 2 мл холодного реактива Илька осторожно добавляют 0,1 мл сыворотки так, чтобы она стекала по стенке пробирки. Во вторую пробирку к реактиву Илька добавляют 0,1 мл стандартного раствора холестерина. Пробирки энергично встряхивают и оставляют на 20 минут в темноте. Затем пробы колориметрируют в кювете толщиной 0,5 см при красном светофильтре против воды. Расчет проводят по обычной формуле (см. занятие 1).

Нормальное содержание холестерина в сыворотке 3,0-6,2 ммоль/л.

2. Определение холестерина липопротеидов высокой плотности (a-холестерин)

Принцип метода. Липопротеиды низкой и очень низкой плотности образуют нерастворимые комплексы с гепарином в присутствие ионов марганца. После осаждения этих комплексов в надосадочной жидкости остаются липопротеиды высокой плотности, в которых определяют a-холестерин по реакции Илька или ферментативным методом.

Ход работы. К 1 мл сыворотки приливают 0,09 мл смеси гепарина и хлористого марганца. Содержимое пробирки хорошо перемешать и оставить на льду на 10 мин. Затем смесь центрифугируют 30 мин при 3000 об /мин. В прозрачном верхнем слое определяют содержание a-холестерина как это описано выше. При расчете в формулу нужно ввести коэффициент 1,09, учитывающий разведение сыворотки при осаждении липопротеидов.

Нормальное содержание a-холестерина в сыворотке – 0,91-1,95 ммоль/л.

3. Расчет коэффициента атерогенности

Коэффициент атерогенности (К) используют при оценке вероятности заболевания атеросклерозом.

К= (общий холестерин -a-холестерин)/a-холестерин

В норме К = 3-4. При возрастании коэффициента риск заболевания увеличивается.

4. Определение холестерина ферментативным методом

Принцип метода. Определение холестерина в сыворотке крови основано на использовании сопряженных ферментативных реакций. При гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода. Под действием пероксидазы пероксид водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Ход работы. 1 мл рабочего реагента наливают в пробирку и ставят в термостат на 5 мин при температуре 37^ОС. Затем добавляют 0,05 мл сыворотки крови. Смесь перемешивают и выдерживают в термостате 20 мин. Измеряют оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине волны 490 нм в кювете на 0,3 см.

Расчет концентрации холестерина проводят по калибровочному графику.

Диагностическое значение определения холестерина

Общий холестерин. Гиперхолестеринемия наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, гипотиреозе, механической желтухе, нефрозах, болезни Иценко-Кушинга. Гипохолестеринемия обнаружена при гипертиреозе, туберкулезе, анемии, голодании, паренхиматозной желтухе, при аддисоновой болезни, врожденных гемолитических анемиях, острых панкреатитах, полиневритах, колитах, при расстройствах питания. При заболеваниях печени снижается количество эфирносвязанного холестерина пропорционально степени нарушения функции печени.

a-холестерин. Снижение концентрации холестерина липопротеидов высокой плотности наблюдается у лиц с ишемической болезнью сердца, обусловленной коронарным атеросклерозом. Каждый из известных факторов риска атеросклероза и ИБС сопряжен со снижением a-холестерина. У лиц с наследственной гипер-a-холестеринемией реже, чем у остальных наблюдается инфаркт миокарда и ИБС.

Проверка качества усвоения знаний (конечный уровень)

а) вопросы к защите лабораторной работы

- Что такое холестерин?

- Объясните принцип метода определения общего холестерина.

- Что такое α-холестерин?

- Каков принцип метода определения холестерина ЛПВП?

- Как рассчитывается коэффициент атерогенности? Какую информацию он дает врачу?

- Для диагностики каких заболеваний используется определение холестерина?

- Почему определение общего холестерина могло бы помочь установить гипотиреоз у детей?

- Почему при сахарном диабете повышен холестерин крови?

- Назовите патологии, при которых снижен холестерин крови.

- Почему повышение ЛПНП тесно связано с гиперхолестеринемией?