Генные мишени

Все гены, составляющие геном патогенных микроорганизмов, как стало ясно относительно недавно, можно разделить на две группы. Первая группа генов объединяется под названием «house keeping genes» (гены, на которых держится «дом», т.е. клетка; они всегда жизненно необходимы для ее существования, т.к. контролируют основные метаболитические процессы). Их еще называют существенные гены. Вторая, менее изученная группа, получившая условное название «гены вирулентности», существенна для сохранения жизнеспособности патогенных микроорганизмов только в условиях инфицированного организма.Кроме генов, непосредственно обусловливающих образование адгезинов и инвазинов, что способствует колонизации бактериальным патогеном животных тканей, в эту группу входят и гены, обязательные для выживания патогена в условиях воздействия на него факторов иммунитета (гены, отвечающие за выработку токсинов), гены, позволяющие микроорганизму преодолевать дефицит некоторых метаболитов и неорганических ионов (например, пуринов и железа) в организме человека, а также гены, кодирующие некоторые регуляторные системы. И те, и другие гены могут быть потенциальными биомишенями для действия лекарственных препаратов.

В принципе любые «house keeping» гены могут являться мишенями для действия антибактериальных препаратов, однако здесь имеется целый ряд существенных ограничений обусловленных общностью многих метаболитических процессов в клетках человека и бактерий. Поэтому для поиска подходящих генных мишеней первоначально проводится анализ и сопоставление геномов микроорганизмов (метаболомика) и выделяются интересующие гены. Затем компьютерным путем они накладываются на геном человека и выделяются гены общие для человека и микроорганизмов (сравнительная геномика). Такие гены исключают из дальнейшего изучения, так как воздействие на них лекарственных препаратов может иметь неблагоприятные последствия для организма человека. Оставшиеся существенные гены могут быть перспективными мишенями для различных фармпрепаратов, как существующих, так и вновь создаваемых. Так, анализ полной последовательности нуклеотидов генома микобактерии - возбудителя туберкулеза - показал, что у бактерии имеются гены, кодирующие синтез жизненно важных для нее ферментов, отсутствующих у человека. На основе такого подхода после прочтения и анализа геномов М.tuberculosis и близких к нему микроорганизмов, в НИИ биомедицинской химии РАМН предсказаны 13 новых мишеней для лекарственных соединений. Поиск лекарств, действующих именно на эти гены или кодируемые ими белки, обещает переворот в борьбе с этой инфекцией, уносящей миллионы человеческих жизней.

Более перспективными биомишенями для химиотерапевтического агента являются гены вирулентности. Подавление генов вирулентности не вызывает прекращения роста патогенных микроорганизмов in vitro, поскольку в этом случае гены вирулентности им не нужны. Однако в условиях in vivo значение генов вирулентности для патогена сравнивается со значением «house keeping genes», и их подавление будет приводить к антимикробному эффекту, поскольку патогенные клетки, потерявшие вирулентность, будет быстро уничтожаться защитными силами организма.

Ингибиторы генов вирулентности оказываются особенно ценными лекарственными веществами. Во-первых, к ним гораздо медленнее, чем к ингибиторам образования, например, клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины) или белка (стрептомицин, тетрациклины, эритромицин и др.), должна развиваться резистентность. Они не будут факторами селекции и распространения резистентных форм бактерий. Во-вторых, гены вирулентности высоко специфичны для каждого патогена: близких к ним генов в клетках организма человека нет. Это значит, что ингибиторы, отобранные по действию на гены вирулентности, более безопасны для человека, чем отобранные по другим тестам.

Для того чтобы использовать гены вирулентности в биоиспытаниях, надо предварительно их выделить и идентифицировать, а затем получить в чистом виде кодируемый ими белок, который можно использован как – мишень в тест-системах. Это не просто, так как гены вирулентности экспрессируются только in vivo, т.е. в инфицированном животном организме. Поэтому гены вирулентности нужно сначала выделить в чистом виде и постараться клонировать и экспрессировать в каком ни будь безопасном и легко культивируемом микроорганизме типа E.coli. Для этого был разработан метод, получивший название «in vivo expression technology» (IVET) используемый для отбора генов вирулентности (ivi гены). Геном исследуемого патогенного микроорганизма фрагментируется с помощью набора рестриктаз: в отдельных фрагментах оказываются или ivi гены, или "жизненно важные" существенные гены необходимые клетке для ее роста и in vivo, и in vitro. Далее проводят их разделение и идентификацию.

Об объеме экспериментов, проводимых с использованием IVET, можно судить, например, по исследованию, в котором проводилась идентификация генов вирулентности Salmonella typhimurium. Было идентифицировано более 100 генов (относящихся к генам вирулентности), из них более 50 оказались ранее не описанными, т.е. не имели гомологии с генами, представленными в базах данных по другим организмам, а функции кодируемых ими белков были неизвестны.

В целом можно сказать, что секвенирование генома позволяет, в конечном счете, выявить абсолютно все уязвимые места клетки патогена как при росте in vitro и in vivo, так и только in vivo, что для клинической практики не менее, а может быть даже и более, важно.

Date: 2016-02-19; view: 614; Нарушение авторских прав