Микроскопическое исследование исходного материала

Возбудитель обнаруживают в мазках, окрашенных по Стампу, Гимза, Маккиавелло и др., а при наличии соответствующих компонентов в реакциях иммунофлуоресценции или при помощи иммунопероксидазного теста.

Предваряя интерпретацию микроскопической картины при изучении ок­рашенных препаратов, более подробно останавливаемся на стадиях мор­фогенеза хламидий. В процессе жизнедеятельности хламидии подвержены следующим морфологическим изменениям («морфогенез»). Вначале клетка хламидий в виде элементарных телец фагоцитируется клеткой-хозяином. Элементарные тельца — электронноплотные шаровидные образования с компактным нуклеоидом, трехслойной клеточной стенкой, диаметром око­ло 0,2-0,25 мкм. В течение нескольких часов после фагоцитоза элементар­ные тельца увеличиваются в размерах и превращаются в ретикулярные формы (инициальные или ретикулярные тельца), которые размножаются путем бинарного деления. Ретикулярные тельца имеют сферическую фор­му, сетчатую структуру, тонкую клеточную стенку и фибриллярный нуклеоид, их размер достигает 0,8-1,5 мкм в диаметре. Промежуточную морфо­логическую стадию между элементарными и ретикулярными тельцами на­зывают промежуточными тельцами. Хламидии размножаются внутри цитоплазматических везикул и формируют микроколонии, окруженные мемб­раной, состоящей из мембраны клетки-хозяина, внедрившейся в цитоплаз­му на стадии фагоцитоза. В составе колоний имеются все три стадии разви­тия хламидий. В одной клетке-хозяине может быть несколько микроколо­ний, число которых соответствует количеству фагоцитированных хлами­дий. Элементарные тельца являются инфекционными, а ретикулярные — вегетативными, неинфекционными. После разрыва стенки везикулы и клет­ки-хозяина освобождающиеся элементарные тельца инфицируют другие клетки и цикл повторяется. В принципе морфогенез хламидий соответству­ет динамике роста и размножения обычной бактериальной клетки на повер­хности плотной питательной среды.

Окраска по Маккиавелло. Мазки фиксируют фламбированием, покрывают полоской фильтроваль­ной бумаги; окрашивают раствором А 5-10 минут; промывают дистиллиро­ванной водой; обрабатывают раствором В 20-30 сек промывают водо­проводной водой; окрашивают раствором С 30 секунд; промывают водой.

Раствор А: 250 мг основного фуксина в 100 мл бидистиллированной воды (хранится 10 дней при 4° С). Раствор В: 10 г лимонной кислоты в 100 мл бидистиллированной воды. Раствор С: 1 г метиленовой сини в 100 мл биди­стиллированной воды.

Микроскопическая картина: хламидии — красного цвета, ядра кле­ток — темно-синие, клетки — светло-синие.

Окраска по методу Романовского раствором Гимза. Мазок фиксируют этанолом, метанолом или спирт-эфиром. Краску до­бавляют в дистиллированную подщелоченную воду (рН 7,4) из расчета 1 капля краски на 1 мл воды. Окрашивание ведут при комнатной температу­ре в течение 16-18 часов (П.Ф. Здродовский). Для выявления микрострук­туры риккетсий автор предлагает фиксировать препараты пикроформолом по Буэну (насыщенный водный раствор пикриновой кислоты — 75 мл, фор­малина — 25 мл, ледяной уксусной кислоты — 5 мл) в течение 30 минут, промывать 2-3 часа дистиллированной водой с трехкратной заменой, да­лее проводить окрашивание в течение 18-20 часов.

Рекомендуется маточный раствор красителя раз­бавлять фосфатно-буферным раствором (рН 7,2). Фиксированные мазки ок­рашивают в специальных кюветах в вертикальном положении при комнат­ной температуре 20-24 часа, промывают дистиллированной водой, обра­батывают 10 секунд подкисленным этанолом (3-5 капель уксусной кисло­ты на 15-20 мл спирта), вновь промывают и микроскопируют.

Р.Х. Хамадаев (1984) рекомендует на фиксированный мазок налить 3-5 капель концентрированного красителя, через 10 минут добавить 3-5 капель дистиллированной воды (рН 6,8-7,0). Окрашивание проводят 16-18 часов. Далее краску смывают, препарат промывают водопроводной водой, обраба­тывают этанолом 1 минуту, промывают дистиллированной водой, вновь диф­ференцируют этанолом 30 секунд, промывают дистиллированной водой.

Микроскопическая картина: хламидии локализуются в цитоплазме в виде единичных клеток или скоплений, имеют красно-фиолетовый цвет, более крупные структуры — сине-фиолетовые.

Окраска по видоизмененному способу Нохта. Мазки фиксируют спирт-эфиром, окрашивают кипящей смесью азура II и эозина с двух-трехкратной сменой красителя через каждые 2-3 минуты в течение 10 минут. Риккетсий в окрашенном препарате имеют розовато-красный цвет. При окраске по этому способу азур II и эозин используют в виде основных водных растворов 1:1000. Обычно на 1 мл дистиллированной воды берут 3 капли азура III и 2 капли эозина.

Окраска по Кастанеда. Препарат не фиксируют. Окрашивают 3-
4 минуты свежеприготовлен­ной смесью азура с формалином и фосфатным буфером, препараты промы­вают водой, в течение нескольких секунд докрашивают раствором сафра­нина, промывают водой и микроскопируют. Микроскопическая картина: риккетсии — сине-фиолетовые, фон —розовый. Недостаток метода — пло­хая дифференциация внутриклеточных риккетсии. Красители и реактивы: 1% водный раствор азура II с добавлением 0,5% формалина; 1% водный раствор сафранина; фосфатный буфер (рН 7,4-7,6); формалин (обычный). Перед окраской к 20 мл фосфатного буфера добавляют 1 мл формалина и 20 капель 1% раствора азура II. Элементарные тельца (инфекционная форма хламидий) имеют округлую форму и размеры 0,2-0,4 мкм, крупные неинфекционные формы достигают 0,5-1,0 мкм.

Согласно действующему наставлению по диагностике хламидиозов мазки или мазки-отпечатки окрашивают по Романовскому-Гимза следую­щим образом. Препараты фиксируют 96% этанолом, метанолом или охлаж­денным безводным ацетоном в течение 5 минут. Затем препараты окраши­вают в течение 1,5 часов краской Романовского-Гимза, разведенной 1:10 фосфатным буфером с рН 7,2-7,6, промывают дистиллированной водой, подсушивают, микроскопируют.

Микроскопическая картина: цитоплазматические включения представ­ляют собой компактные или рыхлые зернистые массы, состоящие из клеток возбудителя на разных стадиях морфогенеза. Они часто находятся вблизи ядра клетки-хозяина, смещая его к стенке клетки. Форма включений может быть правильной и неправильной. Мелкие ранние включения содержат круп­ные тельца и имеют сине-фиолетовый цвет, крупные включения состоят из мелких зернистых структур, имеющих розовый цвет. В одной клетке могут одновременно присутствовать включения разной степени зрелости.

По мнению ряда авторов, окраска по Романовскому-Гимза мало подхо­дит для выявления хламидий в желточных мешках из-за трудности диффе­ренциации возбудителя и детрита.

В окрашенных препаратах возбудитель похож на клетки бруцелл по формам и размерам. Дифференциацию С. psittaci и бруцелл можно провести на основании результатов МФ А, иммунопероксидазной реакции или бак­териологических и серологических исследований.

Окраска по Стампу. Мазки фиксируют фламбированием и окрашивают следующим обра­зом: карболовый фуксин Циля, разведенный дистиллированной водой 1:5 (рН 7,4) — 15 минут; промывание дистиллированной водой; раствор сер­ной кислоты — (0,05%) — 1 минута; промывание дистиллированной водой; водный раствор малахитового зеленого (1%) — 30 секунд; промывание ди­стиллированной водой.

Микроскопическая картина: хламидий — красного цвета, ядра кле­ток — темно-синие; фон — зеленоватый.

Окраска по модифицированному методу Гименеж. Мазки готовят из стенок желточных мешков зараженных куриных эмб­рионов, фиксируют на пламени, окрашивают 5 минут 0,25% водным ра­створом основного фуксина, промывают водой, окрашивают 0,8% водным раствором малахитового зеленого 30 секунд, промывают водой, обесцве­чивают 2 минуты 0,5% раствором лимонной кислоты, промывают, докра­шивают малахитовым зеленым 30 секунд. Затем обесцвечивают 1% раство­ром хлорангидрида 1 минуту, промывают водой и микроскопируют.

Микроскопическая картина: элементарные тельца и тельца включения имеют красный цвет, фон — зеленый.

Окраска акридиновым оранжевым (прямое флуорохромирование). Мазки фиксируют жидкостью Карнуа 5 минут, двукратно отмывают фосфатно-цитратным буфером (рН 3,8) по 2-4 минуты, наносят рабочий раствор акридинового оранжевого на 10-20 минут, трижды промывают фосфатно-цитратным буфером по 2 минуты, препарат заключают в этот буфер, покровное стекло прикрепляют парафином. Препарат исследуют в люминесцентном микроскопе со светофильтрами СЗС, БС и ФС.

Микроскопическая картина: элементарные тельца ярко-зеленые, про­межуточные формы — от соломенно-темного до оранжевого цвета.

Жидкость Карнуа: шесть частей 96% этанола, три части хлороформа, одна часть ледяной уксусной кислоты.

Фосфатно-цитратный буфер (рН 3,8): лимонная кислота — 10 г, Na₂HP0₄ х 7Н₂0 —15 г, дистиллированная вода — 1000 мл.

Маточный раствор акридинового оранжевого: акридиновый оранже­вый — 0,1 г, фосфатно-цитратный буфер —100 мл.

Рабочий раствор красителя готовят в концентрации 1:10 тыс. — 1:30 тыс. с использованием в качестве разбавителя фосфатно-цитратного буфера.

Иммунофлуоресцентное выявление хламидий. Прямой метод иммунофлуоресцещии. Мазки фиксируют холодным аце­тоном 5-10 минут (на холоде), промывают ФСБР, обрабатывают 30-40 минут при 37° С смесью флуоресцирующей (ФИТЦ) хламидийной сыворот­ки и бычьего альбумина, меченного родамином, взятого в удвоенном титре. Далее препараты промывают ФСБР (рН 7,2), наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Микроскопическая картина: хламидии —изумрудно-зеленые, фон — оранжевый.

Коммерческий диагностический набор для выявления хламидии прямым методом, выпускаемый в настоящее время, включает: лиофилизированные моноклональные антитела, меченные ФИТЦ и содержащие краситель Эванса; растворитель для лиофилизированных иммуноглобулинов; жидкость для «заключения» препарата. При использовании этого диагностического на­бора диагноз на хламидиоз считается положительным, если в препарате обнаруживают ярко-зеленые внеклеточные элементарные тельца хламидии округлой формы с ровными краями. Иногда обнаруживаются ретикуляр­ные тельца, размер которых в 2-3 раза больше. Внутриклеточные включе­ния выявляются не более чем в 10% случаев. В качестве отрицательного контроля готовят мазки из аналогичного материала от заведомо здоровых животных.

Непрямой метод реакции иммунофлуоресценции. Мазки фиксируют, как описано выше, после подсушивания на воздухе на 30-40 секунд нано­сят рабочий раствор синьки Эванса (1:10 000), смывают водопроводной водой (слабая струя). Наносят на препарат хламидийную немеченую сыво­ротку в рабочем титре (титр не менее 1:32-1:64), выдерживают 30-40 минут при 37° С. Промывают ФСБР три раза по 5-10 минут. Далее на препарат наносят меченую ФИТЦ антивидовую сыворотку в рабочем тит­ре, выдерживают препарат 30 минут во влажной камере при 37° С, тща­тельно промывают ФСБР и далее исследуют, как описано выше, со свето­фильтрами ФС1-2, БС-8-2, СЗС7-2 и запирающим ЖС18. Микроскопичес­кая картина: хламидии — изумрудно-зеленые, фон — красный разных от­тенков. Вместо синьки Эванса можно брать бычий альбумин, меченный ро­дамином, который в удвоенном титре смешивают с сывороткой первой сту­пени 1:1. Контроли обычные для МФА.

Коммерческий диагностический набор для непрямой МФА содержит не меченные ФИТЦ моноклональные противохламидиозные антитела и соот­ветствующую меченную ФИТЦ антивидовую сыворотку.