Выделение и идентификация культур микоплазм

Культивирова­ние. Выделение М.gallisepticum проводят в соответствии с действующей в РФ инст­рукцией по диагностике респираторного микоплазмоза из материала гото­вят суспензию 1:10 в МПБ с последующей ее обработкой ингибиторами (ацетат таллия, пенициллин) или фильтрацией через мембранные фильтры № 3,4. Посев производят на одну из питательных сред: Эдварда, Хоттингера, Мартена. Из головного мозга посев проводят без обработки материала ингибиторами. Посев материала, взятого тампонами из трахеи, воздухо­носных мешков, а также жидкости из синусов и суставов (0,1 мл) может быть проведен непосредственно в 3-5 мл жидкой питательной среды. При этом оптимальной жидкой питательной средой является среда Фрея, моди­фицированная для птичьих микоплазм. Для культивирования М.gallisepticum в среду Фрея добавляют свиную или лошадиную сыворот­ку. Инкубирование посевов проводят при 37° С в аэробных условиях до 14 суток, прежде чем результат исследования признают отрицательным. По­севы просматривают ежедневно на наличие роста, который проявляется легкой опалесцепцией и слабым помутнением среды. На среде Фрея за счет расщепления глюкозы рост возбудителя сопровождается изменением ее цве­та до оранжевого или желтого. Рекомендуется проводить до 4-5 слепых пассажей с интервалом между посевами в 5 дней, для чего 1 мл засеянной среды переносят в пробирку с 5-10 мл свежей среды без ингибиторов. Параллельно производят высев на аналогичную агаровую среду. Посев материала может быть произведен первоначально непосредственно на ага­ровые среды, однако предварительные пассажи на жидкой среде дают луч­шие результаты. Засеянные агаровые среды в чашках Петри инкубируют 3-5 дней при 37° С во влажной камере, во избежание подсыхания среды, лучше в атмосфере с 5% СО₂. Наличие колоний на плот­ных средах исследуют при помощи микроскопа (х20-х50) в косо падаю­щем пучке света. Типичные колонии имеют диаметр 0,1-1 мм, темный вра­стающий в питательную среду центр, прозрачную периферию (форма «яич­ницы-глазуньи»). В первичных культурах возвышающийся центр может от­сутствовать и проявляется у культур 2-3-го пассажа. Одновременно из культур готовят препараты, окрашенные по Романовскому-Гимза. В поло­жительных случаях в препаратах из седимента бульонной культуры или колоний обнаруживают коккоидные образования светло-фиолетового цве­та, диаметром около 0,25 мкм.

Патогенные микоплазмы вырастают на агаровых средах через 4-
5 дней, а непатогенные виды (М.gallisepticum, M.gallinarum, Acholeplasma) уже через сутки инкубирования. Для подавления роста непатогенных микоплазм реко­мендуется добавлять в среду соответствующие им иммунные сыворотки. Параллельно проводят дифференциацию обнаруженных колоний от L-форм бактерий.

Из отобранных колоний культуру отвивают в жидкую питательную среду или агаровым блоком на свежую агаровую среду без ингибиторов. Проце­дуру повторяют до получения чистой культуры.

Выделение культуры M.sinoviae. Подготовленный материал для выделе­ния этого вида микоплазм высевают на среду Фрея с 10-15% нормальной сыворотки свиньи, инактивированный при 56° С в течение 30 минут, кроме того, в среду добавляют 0,1% восстановленного никотинамида-адениндинуклеотида. Все последующие процедуры по получению чистой культуры возбудителя проводят по вышеописанной схеме.

Выделение культуры M.melagridis. Исследуемый материал для выделения M.melagridis лучше, как и для изоляции M.iowae, высевать на агаровую питательную среду с добавлением лошадиной сыворотки крови. M.melagridis отличается замедленным ростом. Коло­нии M.melagridis, M.synoviae и М.gallisepticum сходны по морфологии.

Идентификация культур микоплазм. Выделенные культуры микоплазм идентифицируют на основании изуче­ния ферментативных, культуральных особенностей, а также при помощи серологических методов. Исследование чувствительности к дигитонину и уреазной активности позволяет определить родовую принадлежность ми­коплазм (Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma). Определение способно­сти к ферментации глюкозы, аргинина и образованию фосфатазы дает воз можность отнести изолят к той или иной ферментативной группе. Дальнейшее изучение ферментативных характеристик позволяет устано­вить видовую принадлежность выделенной микоплазмы (табл. 98).

Таблица 98 - Дифференциальные признаки видов микоплазм,