Выделение и идентификация культур клебсиелл

Культивирование. Клебсиеллы являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофы, обладающие и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптималь­ная температура роста 36-37° С, рН 7,2. Хорошо растут на всех широко используемых в лабораторной практике питательных средах.

Исследуемый материал (за исключением содержимого толстого отдела кишечника и фекалий) высевают в пробирки с МПБ, на МПА, дифференци­ально-диагностические среды Эндо и Плоскирева.

Соскоб с пораженного участка слизистой оболочки тонкого отдела кишечника (примерно 0,5 г) суспендируют в 10 см³ стерильного физиоло­гического раствора, выдерживают для осаждения крупных частиц 10-15 мин при комнатной температуре и надосадочную жидкость высевают на среды Эндо и Плоскирева. Аналогичным образом производится посев фекалий. Посевы инкубируют при 37° С в течение 18-24 часов. По истечении указанного срока пробирки и чашки Петри с посевами просматривают, отбирают характерные для клебсиелл колонии, готовят из них мазки, кото­рые окрашивают по Граму и по Гинсу (для выявления капсул).

При отсутствии роста на плотных питательных средах, но наличии его в МПБ и при обнаружении в нем небольших грамотрицательных палочек осу­ществляют пересев культур из МПБ на плотные питательные среды. Пере­севы инкубируют при указанных выше условиях.

Характерные для клебсиелл колонии, состоящие из грамотрицатель­ных, образующих капсулу палочек, отбирают для дальнейших исследо­ваний.

Характер роста клебсиелл на питательных средах. В жидких питательных средах клебсиеллы растут в виде равномер­ного помутнения с образованием осадка, пленки на поверхности среды, а иногда и пристеночного кольца. Наряду со штаммами, хорошо фер­ментирующими лактозу, имеются и штаммы со слабой лактазной актив­ностью. Поэтому, в зависимости от степени ферментации лактозы, на дифференциально-диагностических средах колонии могут быть как крас­ные, розовые, непрозрачные с металлическим блеском (т.е. напоминаю­щие лактозопозитивные эшерихии), так и прозрачные, бледно-розовые или бесцветные. На среде Плоскирева колонии могут иметь бежевый или желтый оттенок. Во всех случаях колонии имеют гладкую выпук­лую поверхность, ровные края, чаще всего слизистую консистенцию.

На МПА клебсиеллы образуют характерные крупные, выпуклые, сли­зистые, часто сливающиеся колонии. Чаще всего они непрозрачны в прохо­дящем свете, а в косопроходящем свете имеют яркую розово-дымчатую окраску. В мазках, приготовленных из таких колоний и окрашенных по-Гинсу, отчетливо выявляется капсула.

Поскольку характер роста на дифференциально-диагностических сре­дах малоинформативен для суждения о принадлежности выделяемых куль­тур к клебсиеллам, выделение возбудителя из исследуемого материала для учшей дифференциации от эшерихии рекомендуют проводить на 48-часовой агаровой культуре.

Морфология клебсиелл в культуре. В мазках, приготовленных с питательных сред, клебсиеллы обнаружи­вают в виде неподвижных, овальной формы палочек размером 0,3-1,5x0,6-6,0 мкм. Грамотрицательные. Спор лишены, образуют капсулу. В мазках располагаются поодиночке, парами или цепочками.

Идентификация клебсиелл по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для клеб­сиелл культуральными, морфологическими и тинкториальными свойства­ми идентифицируют с целью установления родовой, видовой и подвидовой принадлежности на основании изучения ферментативных свойств.

Клебсиеллы оксидазоотрицательные. Индол не выделяют (за исклю­чением K.oxytoca). По пробе с метиловым красным, реакции Фогеса-Проскауэра, способности расти на среде Симмонса с цитратом виды ва­рьируют. Как правило, по лизиндекарбоксилазе положительные, по ор-иитиндекарбоксилазе и агрининдигидролазе отрицательные. Некоторые видыуреазоположительные. Сероводород не образуют. Способны расти в присутствии KCN. Желатину не разжижают. Большинство видов сбра­живает все обычно тестируемые углеводы, за исключением дульцитола и эритритола с образованием кислоты и газа. Встречаются штаммы, не об­разующие газ.

Дифференцирующие признаки видов рода Klebsiella представлены в таб­лице 35, ферментативные свойства, отличающие подвиды вида K.pneumoniae — в таблице 36.

Определенные трудности возникают в отличии штаммов K.pneumoniae от неподвижных штаммов Enterobacter aerogenes, которые очень медлен­но разжижают желатину. Решающее значение при этом имеют тесты на уреазу (K.pneumoniae подвида pneumoniae уреазоположительные) и орнитиндекарбоксилазу (K.pneumoniae подвида pneumoniae имеют отрица­тельный признак).

Таблица 35 - Дифференцирующие признаки видов рода Klebsiella

Обозначения:«+» — 90% и более штаммов позитивны по данному признаку; «-» — 90% и более штаммов негативны по данному признаку; «х» — 11 - 89% штаммов имеют положительный признак.

У клебсиелл известно более 80 капсульных (К) антигенов, связанных с их капсульной полисахаридной субстанцией.

Лучшее образование последней отмечается при использовании сред, обо­гащенных углеводами или азотом. Капсулы разных К-антигенов имеют принципиально сходное строение. Основу их полисахаридов составляют галактоза, глюкоза, манноза, фруктоза, рамноза. Сахара связаны между собой глюкуроновыми или реже галактоуроновыми кислотами. Это сходство, по мне­нию многих исследователей, является основной причиной наличия выра­женных перекрестных реакций, затрудняющих серотипирование клебсиелл по К-антигену.

О-антигены клебсиелл (известно более 10; однозначного мнения по от­дельным из них у различных авторов нет) также являются полисахаридами.

В отличие от К-антигенов в их составе нет гексуроновых кислот, но имеются типичные для О-антигенов глюкозамин, гептоза и другие компо­ненты. Серотипирование клебсиелл по О-антигену затруднено т.к. требует бескапсульных форм бактерий. Термообработка для этих целей непригод­на, т.к. капсула термостабильна. Получение бескапсульных форм путем длительного пассирования культур на 50%-ном желчном бульоне, также вызывает значительные трудности и малопригодно для повседневной лабораторной практики.

Таблица 36 - Дифференцирующие признаки подвидов